Bjale†Aterese ya bjale: OX11 0DE, UK, Moago wa Taemane, Phaka ya Saense le Boitlhamelo ya Harwell, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Setsi sa Elektroniki sa go tšea diswantšho tša thutaphedi.
Setsi sa karabelo sa go buna seetša sa go raragana 1 (RC-LH1) ke karolo ya motheo ya photosynthetic ya dipaketheria tša phototrophic tše pherese. Re ile ra tsebagatša dibopego tše pedi tša microscopy ya cryo-electron tša RC-LH1 complex go tšwa go Rhodopseudomonas palustris. Sebopego sa tharollo sa 2.65-Å sa RC-LH114-W se raraganego se na le diloupu tše 14 tša subunit LH1 tšeo di dikologilego RC, yeo e šitišwago ke proteine ​​W, mola yeo e raraganego yeo e se nago proteine-W e le sebopego sa RC ka botlalo seo se dikologilwego ke RC. Koaloa 16 subunit LH1 lupu. Papiso ya dibopego tše e fa temogo ya mafolofolo a quinone ka gare ga RC-LH1 complex, go akaretšwa diphetogo tša conformational tšeo di bego di sa ikemišetša pele ge go tlama quinone lefelong la RC QB, gammogo le lefelo la mafelo a go tlama a quinone a thušo, ao a thušago go di fetišetša go RC. Sebopego sa moswananoši sa proteine ​​ya W se thibela go tswalelwa ga seloupu sa LH1, ka go realo se hlola mokero wa go akgofiša phapantšho ya quinone/quinolone.
Matla ao a newago ke photosynthesis a ka tšwetša pele mo e nyakilego go ba bophelo ka moka lefaseng, gomme a na le bokgoni bjo bogolo bja thekinolotši ya diphedi ya letšatši. Ge e dutše e kgothaletša photosynthesis ya lefase ka bophara, dipaketheria tša phototrophic tše pherese le tšona di bontšha mekgwa e fapa-fapanego ya matla le bokgoni bja metaboliki. Di ka phema photosynthesis gomme tša gola bjalo ka dipaketheria tša heterotrophic leswiswing, di ka lokiša naetrotšene le khaponetaeoksaete, tša tšweletša hydrogen le go senya metswako ya monkgo o bose (1-3). E le gore go newe matla bakeng sa ditshepedišo tše, seetša se swanetše go fetošetšwa ka pela le ka bokgoni gore e be matla a dikhemikhale. Tshepetšo ye e thoma ge sedirišwa sa go raragana sa eriele ya go swara seetša se monya seetša gomme se fetišetša maatla ao a swerego go setsi sa karabelo (RC), ka go realo se thoma karoganyo ya tefo (4 – 7). Yuniti ya motheo ya photosynthesis ka dipaketheria tša phototrophic tše pherese e bopilwe ka mohuta wa 2 RC, yeo e dikologilwego ke raraganego ya go buna seetša 1 (LH1), yeo e bopago RC-LH1 core complex. LH1 e bopilwe ke lenaneo la di-heterodimer tša αβ tše di kobegilego, tšeo e nngwe le e nngwe ya tšona e tlamago dimolekule tše pedi tša chlorophyll ya baktheria (BChl) a le carotenoid e tee goba tše pedi (8-12). The bonolo ka ho fetisisa LH1 antenna bopilwe ka 16 kapa 17 αβ heterodimers pota-potileng RC (9-13) ka lupu e koaletsoeng, empa ka tse ling tse rarahaneng konokono, transmembrane peptides sitisa ho tsoela pele ha potolohileng LH1 , Ka tsela eo kgothaletsa quinol / quinone phatlalatso pakeng tsa RC le cytochrome bc1 rarahaneng (11, 13-15) ya go swana le yona. Sebjalo sa phototrophic se se pherese Rhodopseudomonas (Rps.) ke sephedi sa mohlala seo se ka kwešišago phetišetšo ya maatla le dielektherone yeo e thekgago photosynthesis. Sebopego sa mathomo sa kristale sa Rps. Mohlala wa palustris RC-LH1 rarahaneng ke RC, pota-potiloe ke 15 heterodimeric LH1 loops, tse sitisitsoeng ke protheine e sa tsejoeng e bitsoang “Protein W” ( 14 ). Protein-W e ile ya hlaolwa ka morago bjalo ka RPA4402, yeo e lego protheine ya 10.5kDa yeo e sa hlaolwago yeo e nago le di-helices tše tharo tšeo di boletšwego e sa le pele tša transmembrane (TMH) ( 16 ). Re šišinya go reela leina la rpa4402 lephelo leo le ngwalago protheine W go pufW gore le sepelelane le maina ao a šomišwago bakeng sa dikarolwana tša leabela tšeo di ngwalago diyuniti tše nnyane tša RC-L, M (pufL, pufM) le LH1α, β (pufA, pufB). Se se kgahlišago ke gore proteine-W e gona fela mo e ka bago 10% ya RC-LH1, e utolla Rps. palustris e tšweletša dikopano tše pedi tše di fapanego tša RC-LH1. Mona, re tlaleha phahameng-qeto cryo-EM (cryo-EM) dibopeho tsa tse peli konokono rarahaneng, e mong le protheine W le 14 αβ heterodimers, e mong ntle le protheine W le koaloa 16 Heterodimer LH1 lupu. Sebopego sa rena se emela phetogo ya kgato kwešišong ya RC-LH1 complex ya Rps. palustris, ka gobane re sekaseketše palo ya batho ya go swana ya mohuta wo mongwe le wo mongwe gomme re na le tharollo ye e lekanego go abela ka mo go kwagalago peptide ye nngwe le ye nngwe le dipigmente tše di tlemilwego le dilipid le di-quinone tše di amanago. Papiso ya dibopego tše e bontšha gore diproteine ​​tše tharo tša TMH-W tšeo di sego tša hwetšwa ka go RC-LH1 complex efe goba efe go fihla ga bjale di tšweletša mokero wa quinone go akgofiša phapantšho ya quinone/quinolone. Palo ya mafelo a go tlama a lipid le quinone ao a bolokilwego a lemogilwe, gomme re utollotše phetogo ye mpsha ya sebopego ka morago ga kopanyo ya quinone le RC, yeo e ka bago ye e loketšego photosystem II (PSII) RC ya diphedi tša phototrophic tše di nago le oksitšene. Dikutollo tša rena di fa temogo ye mpsha ka ga kinetics ya go tlama le phapantšho ya quinone/quinolone ka gare ga RC-LH1 core complex ya dipaketheria tša phototrophic tše pherese.
Gore go nolofatšwe thuto ye e tletšego ya dikomponi tše pedi tšeo di hwetšwago ka go Rps. palustris, re arola RC-LH1 e nngwe le e nngwe ka mekgwa ya biochemical. Selo se se raraganego seo se hlaelelago proteine ​​W (yeo ka morago se bitšwago ΔpufW) se ile sa hlwekišwa go tšwa go mohuta wo o hlokago lephelo la pufW ( 16 ), gomme ke selo se tee fela sa RC-LH1 se se raraganego seo se ka tšweletšwago. Selo se se raraganego seo se nago le proteine ​​W se tšweletšwa ke mohuta. Proteine ​​W ya mohuta wo e fetotšwe ka tag ya 10x His ka C-terminus ya yona, gore selo se se raraganego seo se nago le proteine ​​W se ka kopanywa ka mo go atlegilego le proteine ​​W ye e hlokago kudu ka go thibela tšhipi. Se se raraganego se arogantšwe ka mo go atlegilego (16) Affinity Chromatography (IMAC).
Bjalo ka ge go bontšhitšwe go Seswantšho 1, dikomponi ka bobedi di na le diyuniti tše tharo tša ka fasana tša RC (RC-L, RC-M le RC-H) tšeo di dikologilwego ke eriele ya LH1. Sebopego sa 2.80-A sa sebopego se se raraganego seo se hlokago proteine-W se bontšha di-heterodimer tše 16 tša αβ, tšeo di bopago selo se se tswaletšwego sa LH1 seo se dikologilego RC ka mo go feletšego, seo ka morago se bitšwago RC-LH116 se se raraganego. Sebopego sa 2.65Å sa protheine-W-e nago le raraganego se na le 14-heterodimer LH1 yeo e šitišitšwego ke proteine-W, yeo ka morago e bitšwago RC-LH114-W.
(A le B) Boemedi bja bokagodimo bja motswako. (C le D) Dipigmente tše di kgokagantšwego tšeo di bontšhitšwego ka dithupa. (E le F) Dikomponi tšeo di hlokometšwego go tšwa go bokagodimo bja cytoplasmic di na le dipeptide le diyuniti tše nnyane tša LH1 tšeo di emetšwego ka dikhathuneng, gomme di nomorilwe ka go lebana le tšhupamabaka go tšwa sekgobeng sa proteine-W [se se sepelelanago le go nomoro ga Rba. sphaeroides rarahaneng (13)]. Bakeng sa LH1-α, mmala wa subunit ya proteine ​​ke o mosehla; bakeng sa LH1-β, mmala wa subunit ya protheine ke o moputsoa; bakeng sa proteine-W, protheine e khubelu; bakeng sa RC-H, ke cyan; bakeng sa RC-L, ke Mmala wa Namune; bakeng sa RC-M, magenta. Di-cofactor di emetšwe ke dithupa, botala bo emela dimolekule tša BChl le BPh a, bophepolo bo emela di-carotenoid, gomme boserolane bo emela dimolekule tša UQ10. (G le H) Pono e godišitšwego ya sekgoba sa proteine-W seleteng se se lekanago sa RC-LH114-W complex (G) le RC-LH116 complex (H). Cofactors di bontšhwa ka mokgwa wa go tlatša sebaka, chelated quinone e bontšhwa ka mmala wo moputswa. Sekgoba sa proteine-W se hlaolwa ka mola wa go kgaoga wo mopududu ka go (G), gomme mekoti ye mennyane yeo quinone/quinolol e phatlaletšego go yona godimo ga lesale la LH116 e hlaolwa ka mola wo motsothwa wo o kgaotšwego ka go (H).
Seswantšho 1 (A le B) se bontšha RC yeo e dikologilwego ke dihlopha tše di bulegilego goba tše di tswaletšwego tša di-heterodimer tša LH1αβ, tšeo e nngwe le e nngwe ya tšona e tlamago BChl tše pedi le carotenoid e tee ( Seswantšho 1, C le D). Dinyakišišo tša peleng di bontšhitše gore Rps ke LH1 complex. Ka tsela ya biosynthetic ya spirulina xanthin, mehuta ye e na le baagi ba go hlakahlakana ba carotenoids ( 17 ). Le ge go le bjalo, spiropyrroxanthin ke carotenoid ye e bušago gomme segokanyipalo sa yona se a kgotsofatša. Ka fao, re ile ra kgetha go dira mohlala wa spiroxanthin mafelong ka moka a go tlama a LH1. Dipolypeptide tša alpha le beta ke di-TMH tše tee tšeo di nago le dilete tša ka ntle tša lera le le kopana ( Seswantšho 1, A, B, E, le F). Le ge e le gore segokanyipalo sa mašaledi a 17 ka C-terminus ga se ya bonwa, alpha polypeptide e ile ya arolwa go tšwa go Met1 go ya go Ala46 ka gare ga dikomponi ka bobedi. β polypeptide e ile ya fokotšwa go tšwa go Gly4 go ya go Tyr52 ka go RC-LH116, le go tšwa go Ser5 go ya go Tyr52 ka go RC-LH114-W. Ga go na segokanyipalo sa mašaledi a 3 goba 4 a N-terminal goba a 13 a C-terminal ao a lemogilwego (Setshwantšho S1). Mass spectrometry and analysis ya hlakanywa RC-LH1 rarahaneng lokisetsa ho tloha hlaha-mofuta mofuta o ile a bontša hore sebakeng se hlaellang e ne e le sephetho sa heterologous cleavage ya dipeptide tsena (Figure S1 le S2). Formylation ya N-terminal ya α-Met1 le yona e ile ya hlokomelwa (f). Tshekatsheko e bontšhitše gore α-peptide e na le mašaledi a fMet1 go ya go Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, gomme β-peptide e na le mašaledi a Ser2 go ya go Ala53, yeo e lego ka kwanong ye botse le mmapa wa segokanyipalo sa EM sa themperetšha ya fase.
Kgokaganyo ya α-His29 le β-His36 e dira gore BChls e lebane le sefahlego; αβ heterodimer e nngwe le e nngwe e kopana le baagišani ba yona go bopa selo se se bulegilego (RC-LH114-W) goba selo se se tswaletšwego (RC-LH116) go dikologa RC The exciton coupled pigment array (Figure 1, C and D). Ge go bapetšwa le sehlopha sa 877 nm sa RC-LH114-W, phetogo ye khubedu ya go monya ya 880 nm ya RC-LH116 ke 3 nm (Figure 2A). Le ge go le bjalo, sepektheramo sa dichroism sa nkgokolo se nyakile go swana (Setshwantšho 2B), se laetša gore le ge go na le phapano ye e kwagalago magareng ga diloupu tše di bulegilego le tše di tswaletšwego, tikologo ya selegae ya BChls e swana kudu. The monya redshift e ka ba sephetho sa fokotsehile mogote tshisinyo le eketsehileng botsitso ka tswaletsoeng lupu (18, 19), phetoho ea pigment coupling bakiloeng ke tswaletsoeng lupu (20, 21), kapa motswako oa liphello tsena tse peli (11).
(A) Ultraviolet / bonahalang / haufi-infrared absorption sepekere, ditlhora tsa tsona di tšoauoa ka pigments bona tshwanelanang le normalized ho BPh tlhōrō ka 775 nm. (B) Sediko dichroism sepekere normalized ho BChl absorbance ka 805 nm. (C le D) Kgethile ΔA spectra ho tloha nako-rarolloa monya spectra ya RC-LH114-W rarahaneng (C) le RC-LH116 rarahaneng (D). Bakeng sa go bapetšwa ga kaone, dispektra ka moka di tlwaelegile go ∆A ya −A ka 0.2 ps. (E) Sekhahla sa cytochrome c2 oxidation ka mor'a mahlaseli a ka ho ba teng ha mahloriso fapaneng ya UQ2 (bona Figure S8 bakeng sa ya data e tala). (F) Ka diseleng hōlile tlas'a tlaase, mahareng kapa phahameng matla leseli (10, 30 kapa 300μMm-2 s-1, ka ho latellana), protheine W le RC-L subunits ka hloekisitsoeng rarahaneng le arohaneng lera karo-karolelano. Laola maemo a protheine ka SDS-polyacrylamide gel electrophoresis le immunoassay (bona Figure S9 bakeng sa ya data e tala). Laola karo-karolelano mabapi le hloekisitsoeng RC-LH114-W rarahaneng. Tekanyo ya stoichiometric ya RC-L go proteine-W ya selo se se raraganego ke 1:1.
The BChls ka boemo ba 1 ka deformed αβ14 lupu ya RC-LH114-W (Figure 1, A, C, le E) ba haufi le RC mantlha mofani wa (P) ka 6.8Å ho feta BChls lekanang ka RC-LH116 (Figure. 1, B, D, le F, le Figure S3); le ge go le bjalo, kinetics ya go monya ya nakwana ya dilo tše pedi tše di raraganego e bontšha gore bakeng sa RC-LH114-W le RC-LH116, diphetolelo tša nako ya phetišetšo ya maatla a go hlohleletša go tšwa go LH1 go ya go RC ke 40 ±4 le 44±3 ps (Figure 2). , C le D, Setšoantšo S4 le Tafole S2). Gape ga go na phapano ye kgolo ya phetišetšo ya elektroniki ka gare ga RC (Setshwantšho S5 le sengwalwa sa tlaleletšo seo se amanago le sona). Re belaela gore go sepelelana kgauswi ga nako ya phetišetšo ya maatla magareng ga LH1 le RC-P go hlolwa ke bokgole bjo bo swanago, khutlo le maatla a kgonagalo ya bontši bja BChl ka gare ga diloupu tše pedi tša LH1. Go bonagala gore go hlahloba mokgwa wa maatla wa LH1 go fihlelela sekgala sa fasefase ga se ka lebelo go feta phetišetšo ya maatla ye e lebanyago go tšwa mafelong a suboptimal go ya go RC. The bulehileng-lupu LH1 lupu ka RC-LH114-W ka 'na hape feta insignificant mogote tshisinyo tlas'a maemo a tlaase mocheso bakeng sa and analysis sebopeho, 'me ho na le nako e telele αβ14 lesale conformation ka mocheso kamoreng ho tloha pigmentation sebaka sa βBChls ka boemo ba RC 1.
RC-LH116 complex e na le 32 BChls le 16 carotenoids, gomme peakanyo ya yona ka kakaretšo e swana le yeo e hweditšwego go tšwa go Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 strain ( PDB ID 7C9R) (12) le botala bolele (Blc.viridis) (ID ya PDB 6ET5) (10). Ka morago ga go logaganya, ke fela dikgelogo tše nnyane maemong a αβ heterodimers tšeo di ilego tša bonwa, kudukudu 1-5, 15, le 16 ( Seswantšho S6 ). Go ba gona ga proteine-W go na le khuetšo ye kgolo go sebopego sa LH1. Di-TMH tša yona tše tharo di kgokagantšwe ka diloupu tše kopana, ka N-terminal ka lehlakoreng la lumen la raraganego le C-terminal ka lehlakoreng la cytoplasmic (Ditshwantšho 1A le 3, A go ya go D). Protein-W ke haholo hydrophobic (Figure 3B), 'me TMH2 le TMH3 sebelisana le LH1αβ-14 ho bopa transmembrane bokagodimo (Figure 3, B le E ho G). Segokaganyi se bopilwe kudu ka mašaledi a Phe, Leu le Val ka seleteng sa transmembrane. Mašaledi a a kgobokeditšwe ka diaminoesiti tša hydrophobic le dipigmente tša αβ-14. Mašaledi a mangwe a polar le ona a tlaleletša tirišanong, go akaretšwa le tlemo ya hydrogen magareng ga W-Thr68 le β-Trp42 godimo ga lešoba le le raraganego (Setshwantšho 3, F le G). Ka holim'a cytoplasm, Gln34 e haufi le sehlopha sa keto sa αβ-14 carotenoids. Go tlaleletša, molekule wa n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) o ile wa rarollwa, gomme mosela wa yona wa hydrophobic o ile wa atološwa go segokanyimmediamentsi sa sebolokigolo magareng ga proteine-W le αβ-14, gomme mosela wa lipid o ka ba o le mmeleng. Re ile ra lemoga gape gore dilete tša tharollo ya C-terminal tša proteine ​​W le RCH di kgauswi kudu, eupša e sego ka gare ga sebaka sa go bopa ditirišano tše itšego ( Seswantšho 1 , A le E ). Le ge go le bjalo, go ka ba le ditirišano ka go diaminoesiti tša C-terminal tšeo di sa rarollwago tša diproteine ​​tše tše pedi, tšeo di ka fago mokgwa wa go thwala proteine-W nakong ya kopano ya RC-LH114-W complex.
. (B) Protein-W e emetšwego ke bokagodimo bja mmala bja hydrophobic. Mafelo a polar le ao a nago le tefo a bontšhwa ka cyan, mafelo a hydrophobic a bontšhwa ka mmala wo mošweu, gomme mafelo a hydrophobic ka maatla a bontšhwa ka mmala wa namune. (C le D) Protein-W e emetšwego ka khathune, tshekamelo ya yona e swana le go (A) (C), gomme e dikološitšwe ka 180° (D). Go ya ka maemo a tatelano, mašaledi ao a hlaolwago a amogela sekema sa mebala ya molalatladi, moo N-terminal e lego ye talalerata gomme C-terminal e lego ye khubedu. (E) Protein-W ka pono e swanago le go (A), gomme mašaledi a segokanyimmediamentsi sa sebolokigolo sa proteine-W: LH1 a emetšwe ke dithupa tšeo di nago le maswao ao a kgomareditšwego. (F) Proteine-W e dikološwa 90 ° ge e bapetšwa le (E) le LH1αβ14 ka boemedi bja khathune, le ge e bapetšwa le mašaledi a segokanyimmediamentsi sa sebolokigolo ka boemedi bja baara. Mašaledi a go lekelela godimo go tšwa go beta polypeptide a swailwe. Cofactor e bontšhwa bjalo ka baara yeo e swanago le mmala wa Seswantšho 1, β-DDM ye e bodilego e bontšhitšwe ka bohlokwa, gomme oksitšene e bontšhitšwe ka mmala wo mohwibidu. (G) Pono yeo e lego go (F) e dikološitšwe ka 180°, ka mašaledi a tšwelelago a polypeptide ya alpha yeo e swailwego.
Protein-W e tšea sebaka sa αβ heterodimer (ya bo-15 go Seswantšho 1F), ka go realo e thibela go tswalelwa ga loop le go sekamiša di-heterodimer tše tharo tša mathomo tša αβ. Go lemogilwe gore khutlo ya go sekama ya palomoka ya heterodimer ya mathomo ya αβ-1 ge e bapetšwa le filimi ye e tlwaelegilego e be e le 25° go ya go 29° (Setshwantšho 1, A le E), yeo e bopilwego ke go sekama ga 2° go ya go 8° ga αβ-1 ka go RC A phapano ye bogale-LH116 (Setshwantšho 1, B le F). Heterodimers ya bobedi le ya boraro di sekame ka 12° go ya go 22° le 5° go ya go 10°, ka go latelelana. Ka lebaka la tšhitišo ya steric ya RC, go sekama ga αβ-1 ga go akaretše para ya bobedi ya αβ (yeo e sepelelanago le αβ ya bo-16 go Seswantšho 1F), ka go realo e bopa sekgoba se se hlakilego ka lesale la LH1 (Setshwantšho 1, A le E) . Ka lebaka la go hloka di-heterodimer tše pedi tša αβ, tšeo di sepedišanago le tahlegelo ya di-BChl tše nne le di-carotenoid tše pedi, ga go le e tee ya di-carotenoid yeo e kgomarelago go yuniti ya ka fasana ya αβ-1 ye e sothegilego, go feletša ka lesale la LH114-W leo le nago le di-carotenoid tše 13 tša Merogo le di-BChl tše 28. Ditekanyetšo tša tharollo ya selegae tša dilo tše pedi tše di raraganego ka dileteng tša αβ1 go ya go tše 7 di fase go feta tša dilo tše dingwe ka moka tša LH1 loop, tšeo di ka bontšhago polasetiki ya tlhago ya subunit ya LH1 yeo e bapilego le lefelo la RC QB (Figure 4) .
Diswantšho tša RC-LH114-W (A le B) le RC-LH116 (C le D) di bontšhwa go tšwa go pono ye e swanago ya godimo/pono ya lehlakore (A le B) (A le C) le bokagodimo bja cavity bja Seswantšho 1. (B le D). Dinotlelo tša mebala di bontšhitšwe ka go le letona.
The feela tšobotsi konokono rarahaneng le stoichiometric karo-karolelano ya 1:14 ke Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Le ge go le bjalo, proteine ​​W le PufX ga di na homology ye e lego molaleng, gomme di na le khuetšo ye kgolo go dibopego tša tšona tša LH1 ka go latelana. PufX ke TMH e tee yeo e nago le domain ya cytoplasmic ya N-terminal yeo e dirišanago le lehlakore la cytoplasmic la subunit ya RC-H (13) maemong ao a sepelelanago le Rps. palustris LH116αβ-16 ya go swana le yona. PufX e hlola mokero wa phapanyetsano ya quinone/quinolone magareng ga RC-LH1 le cytochrome bcl complex gomme e gona ka go Rba ka moka. sphaeroides konokono rarahaneng (13). Le hoja segokanyimmediamentsi sa sebolokigolo monomer-monomer ke ka Rba. The sphaeroides RC-LH1-PufX dimer e teng ka boemo ba tlamang ba protheine W ka RC-LH114-W, 'me sekgoba hlohleletsago ke PufX le protheine-W ke ka boemo bo lekanang (Figure S7A). Sekgoba sa RC-LH114-W se sepelelana gape le mokero wa quinone wa boikgopolelo (8) wa Pseudomonas rosea LH1, yeo e bopilwego ke dipeptide tšeo di sa amanago le proteine ​​W goba PufX ( Seswantšho S7B ). Ho phaella moo, kanale ya quinone ka Blc. LH1 ye tala ya emeralda yeo e bopilwego ka go kgapeletša ka ntle yuniti e tee ya γ (7) e hwetšwa boemong bjo bo swanago (Setshwantšho S7C). Le ge e le gore e tsenywa gare ke diproteine ​​tše di fapanego, ponagalo ya dikanale tše tša quinone/quinolol maemong a tlwaelegilego ka gare ga RC-LH1 complex e bonala e le mohlala wa tlhagelelo ye e kopanago, e laetša gore sekgoba seo se hlotšwego ke proteine ​​W se ka šoma bjalo ka mokero wa quinone.
Sekgoba ka gare ga LH114-W loop se dumelela go bopša ga selete sa lera se se tšwelago pele magareng ga sebaka sa ka gare sa RC-LH114-W complex le lera la bontši (Figure 1G), go e na le go kgokaganya didomene tše pedi ka pore ya proteine ​​bjalo ka ka diprotheine. Selo sa RC-LH116 se raraganego se swana le Tch ye e tswaletšwego. Rarahaneng ya go swana le nalete (22) (Setshwantsho 1H). Ka ge go phatlalatšwa ga quinone ka lera go le ka lebelo go feta go phatlalatšwa ka mokero o mosesane wa proteine, selo se se bulegilego sa LH114-W se ka dumelela phetogo ya RC ka lebelo go feta selo se se tswaletšwego sa LH116, gomme phatlalatšo ya quinone ka gare ga RC e ka ba e thibetšwe kudu. E le hore ho leka hore na protheine W ama phetolo ya quinones ka RC, re ile ra etsa cytochrome oxidation assay ka mahloriso itseng a ubiquinone 2 (UQ2) (analogue ea tlhaho UQ10 le mosela o mokhutšoanyane isoprene) (Figure 2E). Le ge e le gore go ba gona ga quinone ya chelated go šitiša boikemišetšo bjo bo nepagetšego bja go bonagala ga Michaelis ka mehla (RC-LH114-W le RC-LH116 di loketše 0.2±0.1μM le 0.5±0.2μM, ka go latelelana), seelo se segolo sa RC-LH114-W ( 4.6±0.2 e-RC-1 s-1) ke 28±5% e kgolo go feta RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Re ile ra hakanya qalong hore protheine-W e teng ka hoo e ka bang 10% ya konokono rarahaneng ( 16 ); mo, ditekanyo tša go dula ga disele tša kgolo ya seetša se senyenyane, seetša sa magareng, le seetša se segolo ke 15±0.6%, 11±1% le 0.9±0.5, ka go latelelana % (Figure 2F). Papiso ya boleng ya spectrometry ya boima e bontšhitše gore tlaleletšo ya tag ya histidine ga se ya fokotša bontši bjo bo lekanyeditšwego bja proteine-W ge e bapetšwa le mehuta ya mohuta wa hlaga (P = 0.59), ka fao maemo a ga se selo sa kgale sa proteine-W ye e fetotšwego (Figure S10). Le ge go le bjalo, go dulwa mo ga fase ga proteine-W ka gare ga RC-LH1 complex go ka dumelela di-RC tše dingwe go flip ka lebelo le le akgofilego, ka go realo go fokotša phapantšho ya quinone/quinolone ye e nanyago ka gare ga RC-LH116 complex. Re lemogile gore seelo se se phagamego sa go dula ga seetša ga se sepelelane le ya data ya morago bjale ya transcriptomics, yeo e bontšhago gore polelo ya dikarolwana tša leabela tša pufW e oketšega ka tlase ga seetša se matla (Figure S11) (23). Phapano magareng ga go ngwalollwa ga pufW le go tsenywa ga proteine-W ka gare ga RC-LH1 complex e a gakantšha gomme e ka bontšha taolo ye e raraganego ya proteine.
Ka RC-LH114-W, 6 cardiolipin (CDL), 7 phosphatidylcholine (POPC), 1 phosphatidylglycerol (POPG) le 29 β-DDM dimolekule di abetšwe le go swantšhwa ka go yona 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs le 12 βDDMs. RC-LH116 (Setšoantšo 5, A le B). Dibopegong tše tše pedi, CDL e nyakile e le ka lehlakoreng la cytoplasmic la selo se se raraganego, mola POPC, POPG le β-DDM di le kudu ka lehlakoreng la luminal. Dimolekule tše pedi tša lipid le sehlatswa di ile tša arolwa ka seleteng sa αβ-1 go ya go αβ-6 sa RC-LH114-W complex (Figure 5A), gomme tše hlano di ile tša arolwa ka seleteng se se lekanago sa RC-LH116 (Figure 5B ). Di-lipid tše dintši di ile tša hwetšwa ka lehlakoreng le lengwe la selo se se raraganego, kudu-kudu CDL, yeo e kgobokeditšwego magareng ga RC le αβ-7 go ya go αβ-13 ( Seswantšho 5 , A le B ). Dilipid tše dingwe tše di rarolotšwego ka sebopego le dihlatswa di hwetšwa ka ntle ga lesale la LH1, gomme diketane tša acyl tšeo di rarolotšwego gabotse di atologela magareng ga diyuniti tše nnyane tša LH1, tšeo di hlaotšwego ka go se kgonthišege bjalo ka β-DDM ka go RC-LH114-W, gomme di hlalošitšwe bjalo ka β-DDM ka go RC Motswako wa β-DDM le POPC-LH116. Maemo a swanago a di-lipid tša chelating le dihlatswa-sebopego ka sebopegong sa rena a bontšha gore ke mafelo a go tlama a maleba a fisioloji (Setshwantšho S12A). Maemo a dimolekule tše di lekanago ka go Tch le ona a na le go se fetoge mo go botse. Bonolo le Trv. Mohuta wa 970 RC-LH1s (Figure S12, B go ya go E) (9, 12) le mašaledi a hydrogen-bonding a sehlopha sa hlogo ya lipid a bontšhitše pabalelo ye botse ka toka ka go lolamisiwa ga tatelano (Figure S13), e laetša gore Conserved CDL yeo e tlamago go RC (24), mafelo a a ka bolokwa ka gare ga RC-LH1 complex.
(A le B) Dipeptide tša RC-LH114-W (A) le RC-LH116 (B) di emetšwe ke dikhathune, gomme dipigmente di emetšwe ka dithupa, go šomišwa sekema sa mebala go Seswantšho 1. Dilipid di bontšhitšwe ka mmala wo mohwibidu, gomme dihlatswa di bontšhitšwe ka bohlokwa. UQ yeo e tlemilwego go mafelo a RC QA le QB ke ye serolane, mola UQ ye e arotšwego e le ye talalerata. (C le D) Dipono tše di swanago le tša (A) le (B), ka di-lipid tše di tlogetšwego. (E go ya go G) Pono ye e godišitšwego ya Q1(E), Q2(F) le Q3(G) go tšwa go RC-LH116, ka diketane tša ka mahlakoreng tšeo di tutuetšago. Ditlemo tša hydrogen di bontšhwa bjalo ka mela ye metšo ya go kgaoga.
Ka RC-LH116, bobedi RC QA le QB UQ, tšeo di tšeago karolo phetišetšong ya dielektherone tshepedišong ya karoganyo ya tefo, di bola mafelong a tšona a go tlama. Le ge go le bjalo, ka go RC-LH114-W, QB quinone ga se ya rarollwa gomme e tla ahlaahlwa ka botlalo ka fase. Go tlaleletša go QA le QB quinones, dimolekule tše pedi tša UQ tše di chelated (tšeo di lego magareng ga mehele ya RC le LH1) di abetšwe ka sebopegong sa RC-LH114-W go ya ka dihlopha tša tšona tša dihlogo tšeo di rarolotšwego gabotse (tšeo di lego ka Q1 le Q2, ka go latelelana). sekgoba). Seswantšho 5C). Diyuniti tše pedi tša isoprene di abetšwe Q1, gomme mmapa wa segokanyipalo o rarolla mesela ye 10 ya isoprene ye e feletšego ya Q2. Ka sebopego sa RC-LH116, dimolekule tše tharo tša UQ10 tše di chelated (Q1 go ya go Q3, Seswantšho 5D) di ile tša rarollwa, gomme dimolekule ka moka di na le segokanyipalo se se hlakilego go ralala le mosela (Setshwantšho 5, D go ya go G). Dibopegong tše pedi, maemo a dihlopha tša hlogo ya quinone tša Q1 le Q2 a na le go se fetoge mo go botse kudu (Setshwantšho S12F), gomme a dirišana le RC fela. Q1 e mojakong wa sekgoba sa W sa RC-LH114-W (Setshwantsho 1G le 5, C, D le E), mme Q2 e haufi le sebaka sa ho tlama sa QB (Setshwantsho 5, C, D) le F). Mašaledi a L-Trp143 le L-Trp269 a bolokilwego a kgauswi kudu le Q1 le Q2 gomme a fa ditirišano tša kgonagalo ya π-stacking ( Seswantšho 5, E le F, le Seswantšho S12). L-Gln88, 3.0 Å go tšwa go oksitšene ya kgole ya Q1, e fa kgokagano ye maatla ya hydrogen ( Seswantšho 5E); mašaledi a a bolokilwe ka go di-RC ka moka ntle le kamano yeo e lego kgole kudu (Setshwantšho S13). L-Ser91 e tšeetšwe legato ka go boloka Thr ka bontši bja di-RC tše dingwe (Setshwantšho S13), ke 3.8 Angstroms go tšwa go oksitšene ya methyl ya Q1, gomme e ka fa ditlemo tša hydrogen tše di fokolago (Setshwantšho 5E). Q3 ga e bonagale e na le tirišano ye e itšego, eupša e hwetšwa ka seleteng sa hydrophobic magareng ga subunit ya RC-M le subunit ya LH1-α 5 go ya go 6 (Setshwantšho 5, D le G). Q1, Q2 le Q3 goba di-quinone tša kgauswi tša chelated le tšona di rarolotšwe ka go Tch. Boleta, Trv. Mohuta wa 970 le Blc. Sebopego sa iris (9, 10, 12) se šupa lefelo la go tlama la quinone la thušo leo le bolokilwego ka gare ga RC-LH1 complex (Figure S12G). Di-UQ tše hlano tše di bodilego ka go RC-LH116 di kwana gabotse le 5.8±0.7 ya go raragana mo gongwe le mo gongwe mo go beilwego ke chromatography ya seela ya tshepedišo ya godimo (HPLC), mola di-UQ tše tharo tše di bodilego ka go RC-LH114-W di le fase go feta Boleng bjo bo lekantšwego bja 6.2±0.3 (Fig. S14) bo bontšha gore go na le dimolekule tša UQ tšeo di sa rarollwago ka sebopegong.
Dipolypeptide tša L le M tša pseudo-symmetric ye nngwe le ye nngwe e na le di-TMH tše hlano gomme e bopa heterodimer yeo e kopanyago dimer e tee ya BChl, dimonomer tše pedi tša BChl, dimonomer tše pedi tša bacteriophage (BPh), le tšhipi e tee yeo e sego ya Heme le molekule o tee goba tše pedi tša UQ10. Ka go ba gona ga ditlemo tša hydrogen sehlopheng sa ketone sa mafelelo le go kgoboketšwa ga yona mo go tsebjago ka Rps, di-carotenoid di tsenywa ka gare ga M-subunit, yeo e bitšwago cis-3,4-dehydroorhodopin. Mehuta ya diphedi (25). Domain ya lera la ka ntle la RC-H e tsemilwe go lera ka TMH e tee. Sebopego sa kakaretšo sa RC se swana le diyuniti tše tharo tša ka fasana tša RC tša mehuta ye e amanago (go swana le Rba). sphaeroides (ID ya PDB: 3I4D). Di-macrocycle tša BChl le BPh, mokokotlo wa carotenoid le tšhipi yeo e sego ya heme di a swana ka gare ga tekanyo ya tharollo ya dibopego tše, go swana le sehlopha sa hlogo ya UQ10 lefelong la QA le quinone ya QB go RC-LH116 (Setshwantšho S15).
Go ba gona ga dibopego tše pedi tša RC tšeo di nago le ditekanyo tše di fapanego tša go dulwa ga lefelo la QB go fa sebaka se sefsa sa go hlahloba diphetogo tša conformational tše di sa fetogego tšeo di sepedišanago le go tlama ga QB quinone. Ka RC-LH116 rarahaneng, QB quinone e teng ka ka botlalo tlama "proximal" boemo ( 26 ), empa karohano ea RC-LH114-W ha e na QB quinone. Ga go na QB quinone ka go RC-LH114-W, yeo e makatšago ka gobane selo se se raraganego se a šoma, go feta RC-LH116 complex yeo e nago le QB quinone yeo e rarolotšwego ka sebopego. Le ge e le gore diring tše pedi tša LH1 di chelate di-quinone tše ka bago tše tshela, tše hlano di rarolotšwe ka sebopego ka gare ga lesale la RC-LH116 leo le tswaletšwego, mola e le tše tharo feela tšeo di lekanyeditšwego ka sebopego ka gare ga lesale le le bulegilego la RC-LH114-W . Bolwetši bjo bjo bo oketšegilego bja sebopego bo ka bontšha go tšeelwa legato ka lebelo ga mafelo a RC-LH114-W QB, kinetics ya quinone ka lebelo ka gare ga selo se se raraganego, le kgonagalo ye e oketšegilego ya go tshela selo sa LH1. Re šišinya gore go hloka UQ setšeng sa RC QB sa RC-LH114-W e ka ba sephetho sa go raragana kudu le mo go šomago kudu, gomme lefelo la QB la RC-LH114-W le gatseditšwe ka pela ka phetogong ya UQ Mogato o itšego (mojako wa lefelo la QB o tswaletšwe) o bontšha conformation ya mošomo wo.
Ntle le QB, go dikološa mo go sepelago le L-Phe217 go boemo bjo bo sa sepelelanego le go tlama ga UQ10, ka gobane go tla hlola thulano ya sebaka le yuniti ya mathomo ya isoprene ya mosela (Setshwantšho 6A). Go tlaleletša, diphetogo tše kgolo tše di lego molaleng tša conformational di molaleng, kudukudu helix de (helix ye kopana ka gare ga seloupu magareng ga TMH D le E) moo L-Phe217 e šuthišetšwago go potleng ya go tlama ya QB le go dikološa ga L-Tyr223 (Figure 6A ) Go roba tlemo ya hydrogen le tlhako ya M-Asp45 le go tswalela mojako wa lefelo la go tlama la QB (Setshwantsho sa 6B). Helix de pivots motheong wa yona, Cα ya L-Ser209 e šuthišwa ka 0.33Å, mola L-Val221Cα e šuthišwa ka 3.52Å. Ga go na diphetogo tše di bonagalago go TMH D le E, tšeo di ka bewago godimo ka dibopegong ka bobedi (Setshwantšho 6A). Go ya ka fao re tsebago, ye ke sebopego sa mathomo ka go RC ya tlhago yeo e tswalelago lefelo la QB. Papiso le sebopego se se feletšego (QB-bound) e bontšha gore pele ga ge quinone e fokotšwa, phetogo ya conformational e a nyakega go dira gore e tsene ka gare ga quinone. L-Phe217 e dikologa go bopa tirišano ya π-stacking le sehlopha sa hlogo ya quinone, gomme helix e šuthišetšwa ka ntle, e dumelela marapo a L-Gly222 le ketane ya ka thoko ya L-Tyr223 go bopa netweke ya kgokagano ya hydrogen yeo e nago le sebopego sa kgokagano ya hydrogen ye e tsepamego (Setshwantšho 6, A le C).
(A) Khathune ye e lekeletšego ya hologram (ketane ya L, ketane ya mmala wa namune/M, magenta) le sebopego sa apo (bohlokwa), yeo go yona mašaledi a bohlokwa a bontšhwago ka mokgwa wa boemedi bja go swana le molamu. UQ10 e emetšwe ke baara ye serolane. Mothaladi wa marontho o bontšha ditlemo tša hydrogen tšeo di bopilwego ka sebopegong ka moka. (B le C) Boemedi bja godimo bja apolipoprotein le sebopego ka moka sa lesale, se gatelela oksitšene ya ketane ya ka thoko ya L-Phe217 ka mmala wo moputswa le L-Tyr223 ka mmala wo mohwibidu, ka go latelelana. Yuniti ya ka fasana ya L ke ya mmala wa namune; diyuniti tše nnyane tša M le H ga di na mebala. (D le E) Apolipoprotein (D) le kaofela (E) RC QB libaka [mala ka (A) ka ho latellana] le Thermophilus thermophilus PSII (botala, boputsoa le polasetiki quinone; PDB ID: 3WU2) Logaganya (58).
Ka mo go sa letelwago, le ge e le gore dibopego tše mmalwa tša di-RC tšeo di hlaelelago QB tšeo di se nago LH1 di a hwetšagala, diphetogo tša sebopego tšeo di lemogilwego mo nyakišišong ye ga se tša begwa peleng. Tše di akaretša sebopego sa go fokotšega ga QB go tšwa go Blc. viridis (ID ya PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (ID ya PDB: 1EYS) (28) le Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), tšeo ka moka di nyakilego di swana le sebopego sa tšona ka kakaretšo sa QB. Tlhahlobo ya kgauswi ya 3PRC e utollotše gore dimolekule tša sehlatswa sa LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) di tlama mojakong wa maemo a QB, tšeo di ka thibelago peakanyoleswa go ba sebopego se se tswaletšwego. Le ge e le gore LDAO ga e bole maemong a go swana ka go 1EYS goba 1OGV, di-RC tše di lokišitšwe ka go šomiša sehlatswa se se swanago gomme ka fao di ka tšweletša khuetšo ye e swanago. Sebopego sa kristale sa Rba. Sphaeroides RC co-crystallized le cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) le yona go bonala e na le lefelo la QB leo le tswaletšwego. Le ge go le bjalo, tabeng ye, selete sa N-terminal sa polypeptide ya RC-M (se dirišana le lefelo la go tlama la QB ka tlemo ya H ya mašaledi a Tyr go helix ya Q) se amogela conformation yeo e sego ya tlhago, gomme phetogo ya conformational ya QB ga e hlahlobje gape (30 ). Seo se kgothatšago ke gore ga se ra bona mohuta wo wa go senyegelwa ke sebopego ga polypeptide ya M ka sebopegong sa RC-LH114-W, seo se nyakilego se swana le selete sa N-terminal sa RC-LH116 RC. Gape go swanetše go lemogwa gore ka morago ga go fedišwa ga eriele ya LH1 yeo e theilwego go sehlatswa, di-RC tša apolipoprotein ka go PDB di ile tša rarollwa, tšeo di ilego tša fediša matamo a quinone a ka gare le di-lipid sekgobeng magareng ga RC le bokagodimo bja ka gare bja lesale la LH1 leo le dikologilego ( 31 , 32 ). RC e dula e šoma ka gobane e boloka di-cofactor ka moka, ntle le quinone ya QB yeo e bolago, yeo e sa tsepamago kudu gomme gantši e lahlega nakong ya tshepedišo ya go lokišetša (33). Go tlaleletša, go a tsebega gore go tlošwa ga LH1 le di-lipid tša tlhago tša modikologo go tšwa go RC go ka ba le khuetšo go mešomo, go swana le bophelo bjo bo khutsofaditšwego bja boemo bja P + QB bjo bo arotšwego ka tefo ( 31 , 34 , 35 ). Ka fao, re fopholetša gore go ba gona ga lesale la LH1 la selegae leo le dikologilego RC go ka boloka lefelo la QB leo le “tswaletšwego”, ka go realo go boloka tikologo ya selegae kgauswi le QB.
Le ge e le gore apolipoprotein (ntle le QB quinone) le sebopego se se feletšego di emela diswantšho tše pedi fela tša go fetoga ga lefelo la QB, go e na le letoto la ditiragalo, go na le ditšhupetšo tša gore go tlama go ka gated go thibela go tlama gape ka hydroquinone Go thibela thibelo ya substrate. Tšhomišano ya quinolol le quinone kgauswi le lefelo la QB la apolipoprotein e ka ba ye e fapanego, yeo e lebišago go go ganwa ga yona ke RC. Ke kgale go šišinywa gore diphetogo tša conformational di kgatha tema go tlama le go fokotšeng ga di-quinone. Bokgoni bja di-RC tše di gatseditšwego bja go fokotša di- quinone ka morago ga go tlwaelana le lefsifsi bo senyegile ( 36 ); X-ray crystallography bontša hore tshenyo ena ke ka lebaka la QB quinones ho tšoaroa ka "distal" conformation ka 4.5 Å ho tloha mafolofolo proximal boemo (26) , 37). Re šišinya gore conformation ye ya go tlama ya kgole ke seswantšho sa maemo a magareng magareng ga apolipoprotein le sebopego sa lesale ka botlalo, seo se latelago tirišano ya mathomo le quinone le go bulwa ga lefelo la QB.
Mohuta wa II RC wo o hweditšwego ka gare ga PSII complex ya dipaketheria tše itšego tša phototrophic le cyanobacteria, bolele le dimela e na le pabalelo ya sebopego le ya mošomo ( 38 ). Go logaganya ga sebopego mo go bontšhitšwego go Seswantšho 6 (D le E) go gatelela go swana magareng ga di-RC tša PSII le lefelo la QB la RC complex ya baktheria. Papiso ye ke kgale e le mohlala wa go ithuta ditshepedišo tše di amanago kgauswi tša go tlama le go fokotša quinone. Dikgatišo tša peleng di šišinya gore diphetogo tša conformational di sepelelana le phokotšo ya PSII ya quinones ( 39 , 40 ). Ka fao, ge go lebelelwa pabalelo ya tlhagelelo ya RC, mokgwa wo wa go tlama wo o bego o sa hlokomelwe peleng o ka šoma gape le lefelong la QB la PSII RC ka dibjalong tša phototrophic tše di nago le oksitšene.
Rps ΔpufW (go phumolwa ga pufW mo go sa swaiwago) le PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W yeo e bontšhitšwego go tšwa go lefelo la tlhago la pufW) mehuta. palustris CGA009 e hlalositšwe mošomong wa rena wa peleng ( 16 ). Mehuta ye le motswadi wa mohuta wa hlaga wa isogenic di ile tša hwetšwa go tšwa go sehatsetsing ka go streaking palo ye nnyane ya disele godimo ga PYE (e nngwe le ye nngwe ya 5 g ya litara -1) (yeo e bolokilwego ka gare ga LB ka -80 °C, yeo e nago le 50% ( w/v) glycerol) proteine, tomoso setsopolwa le succinate) agar [1.5% (w/v)] poleiti. Poleiti e ile ya bjalwa bošego ka moka leswiswing ka themperetšha ya phapoši ka fase ga maemo a anaerobic, gomme ka morago ya bonešwa ka seetša se sešweu (~50 μmolm-2 s-1) yeo e filwego ke di-bulb tša halogen tša OSRAM 116-W (RS Components, UK) ka matšatši a 3 go ya go a 5 go fihlela koloni e tee e tšwelela. Koloni e tee e ile ya šomišwa go entela 10 ml ya M22+ medium (41) yeo e tlaleleditšwego ka 0.1% (w/v) ya diesiti tša casamino (ka morago ga fao di bitšwa M22). Setšo se ile sa bjalwa ka fase ga maemo a fase a oksitšene leswiswing ka 34°C ka go šišinywa ka 180 rpm ka diiri tše 48, gomme ka morago 70 ml ya setšo e ile ya enwa ka fase ga maemo a go swana ka diiri tše 24. Setšo sa seka-aerobic seo se nago le bophagamo bja 1 ml se šomišwa go entela 30 ml ya M22 magareng ka gare ga 30 ml ya bokahohleng ya sekurufu-top ya khalase ye e bonagalago gomme ya hlasetšwa ka khuduego (~50μmolm-2 s-1) ka diiri tše 48 ka maatla a makenete a go hloka malwetši Molamu wa go hlohleletša. Ka morago ga fao 30 ml ya setšo e ile ya enwa ka dilitara tše ka bago 1 tša setšo ka fase ga maemo a go swana, yeo ka morago e ilego ya šomišwa go enwa dilitara tše ka bago tše 9 tša setšo se se bonešitšwego ka ~200 μmolm-2 s-1 ka diiri tše 72. Disele di ile tša bunwa ka centrifugation ka 7132 RCF ka metsotso ye 30, tša emišwa gape ka gare ga ~ 10 ml ya 20 mM tris-HCl (pH 8.0), gomme tša bolokwa ka -20°C go fihlela go nyakega.
Ka morago ga go tologa, oketša dikristale tše dingwe tša deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) le matlapa a mabedi a Roche holoenzyme protease inhibitor (Merck, UK) go disele tše di emišitšwego gape. Ka seleng ya kgatelelo ya Fora ya 20 000 psi (Aminco, U.S.A.), disele di ile tša šitišwa ka makga a 8 go ya go a 12. Ka morago ga go tloša disele tše di sa robegago le ditlakala tše di sa qhibidigego ka go centrifugation ka 18,500 RCF ka metsotso ye 15 ka 4°C, lera le ile la tšhollwa go tšwa go lysate ya pigmented ka centrifugation ka 113,000 RCF ka diiri tše 2 ka 43,000°C. Lahla karolwana ye e qhibidigago gomme o emiše gape lera la mmala ka gare ga 100 go ya go 200 ml ya 20 mM tris-HCl (pH 8.0) gomme o e homogenize go fihlela go se na di-aggregate tše di bonagalago. Lera le emišitšwego le ile la bjalwa ka gare ga 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) yeo e nago le 2% (w/v) β-DDM ka iri ye 1 leswiswing ka 4°C ka go hlohleletša ka bonolo. Ke moka o centrifuge ka 70°C go hlatswa 150,000 RCF ka 4°C ka iri ye 1 go tloša mašaledi a dilo tše di sa hlakanegego.
Lera la go qhibidiga go tšwa go mohuta wa ΔpufW le ile la dirišwa go kholomo ya phapanyetsano ya ion ya DEAE Sepharose ya 50 ml ka dibolumo tše tharo tša kholomo (CV) tša buffer ya go tlama [20 mM tris-HCl (pH 8.0) yeo e nago le 0.03% (w / v) β-DDM]. Hlatswa kholomo ka di-buffer tše pedi tša go tlama tša CV, gomme ka morago o hlatswe kholomo ka di-buffer tše pedi tša go tlama tšeo di nago le 50 mM NaCl. The RC-LH116 rarahaneng ile eluted le linear gradient ya 150 ho 300 mM NaCl (ka tlamang buffer) ka 1.75 CV, 'me setseng tlama rarahaneng ile eluted le tlamang buffer e nang le 300 mM NaCl ka 0.5 CV. Kgoboketša sepektheramo sa go monya magareng ga 250 le 1000 nm, boloka karolwana yeo e nago le tekanyo ya go monya (A880/A280) ye kgolo go feta 1 go 880 go ya go 280 nm, e hlapološe gabedi ka gare ga buffer ya go tlama, gomme o šomiše tshepedišo ye e swanago gape godimo ga kholomo ya DEAE Ka tlhwekišo. Hlatswa dikarolwana tše di nago le dikarolwana tša A880/A280 tše di phagamego go feta 1.7 le ditekanyo tša A880/A805 tše di phagamego go feta 3.0, dira tikologo ya boraro ya phapantšho ya ion, gomme o boloke dikarolwana tše di nago le dikarolwana tša A880/A280 tše di phagamego go feta 2.2 le dikarolwana tša A880/A805 tše di phagamego go feta 5.0. Se se raraganego seo se hlwekišitšwego ka bontši se ile sa tsepama go fihla go ~ 2 ml ka gare ga filtara ya centrifugal ya Amicon 100,000 ya boima bja dimolekule ya go kgaolwa (MWCO) (Merck, UK), gomme ya imelwa godimo ga kholomo ya go kgaphelwa ka ntle ya bogolo bja Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) yeo e nago le 200 mM NaCl buffer, gomme ka morago ya hlatswiwa ka gare ga buffer ye e swanago ka 1.5 CV. Kgoboketša dispektra tša go monya tša karolwana ya go kgaphelwa ka ntle ga bogolo, gomme o tsepamiše dispektra tša go monya ka dikarolwana tša A880/A280 godimo ga 2.4 le dikarolwana tša A880/A805 godimo ga 5.8 go ya go 100 A880, gomme o di šomiše ka pela bakeng sa go lokišetša keriti ya cryo-TEM goba poloko Boloka go -80°C go fihlela go nyakega.
Lera la go qhibidiga go tšwa go mohuta wa PufW-His le ile la dirišwa go kholomo ya 20 ml ya HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 mM tris-HCl (pH 8.0) yeo e nago le 200 mM NaCl le 0.03% (w/w)) ka gare ga IMAC buffer ( GE Healthcare). v) β-DDM ya go dira bjalo]. Kholomo e ile ya hlatswiwa ka di-CV tše hlano tša IMAC buffer, gomme ka morago ka di-CV tše hlano tša IMAC buffer yeo e nago le 10 mM histidine. Se se raraganego sa motheo se ile sa hlatswiwa go tšwa kholomong ka dibuffer tše hlano tša IMAC tšeo di nago le 100 mM histidine. Karolwana yeo e nago le RC-LH114-W complex e tsepame go fihla go ~ 10 ml ka tankeng ye e hlohleleditšwego yeo e hlomilwego ka filtara ya Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK), e hlapolotšwe ka makga a 20 ka buffer ya go tlama, gomme ya tlaleletšwa go 25 ml Ka kholomong ya DEAE Sepharose, di-CV tše nne tšeo di tlemilwego go buffer di šomišwa e sa le pele. Hlatswa kholomo ka di-buffer tše nne tša go tlama tša CV, ke moka o hlatswa selo se se raraganego go di-CV tše seswai ka gradient ya mothalo ya 0 go ya go 100 mM NaCl (ka gare ga buffer ya go tlama), le di-CV tše nne tše di šetšego tšeo di nago le buffer ya go tlama ya 100 mM Di-complex tša mašaledi di hlatswitšwe godimo ga sodium chloride yeo e kopantšwego le tekanyo ya A880/A280 yeo e phagamego go feta 2.4 le A880 / A805 karo-karolelano phahameng ho feta 4.6 dikarolwana ba ne ba tsepamisitsoeng ho ~ 2 ml ka Amicon 100,000 MWCO centrifugal filtara, le tlala ka 1.5 CV IMAC esale pele Buffer equilibrated Superdex 200 16 / 600 boholo exclusion kholomo, 'me joale eluted ka buffer e tšoanang ka 1.5 CV. Kgoboketša dispektra tša go monya tša dikarolwana tša go kgaphelwa ka ntle ga bogolo gomme o tsepamiše dispektra tša go monya ka dikarolwana tša A880/A280 godimo ga 2.1 le dikarolwana tša A880/A805 godimo ga 4.6 go ya go 100 A880, tšeo di šomišwago gateetee go lokišetša keriti ya TEM ye e gatseditšwego goba di bolokwa ka -80°C go fihlela di nyakega.
Sehatsetsing sa go inela sa Leica EM GP se ile sa šomišwa go lokišetša digridi tša TEM tša themperetšha ya fase. Se se raraganego se ile sa hlapološwa ka gare ga IMAC buffer go A880 ya 50, gomme ka morago 5μl e ile ya imelwa godimo ga letlooa la koporo leo le sa tšwago go tšhollwa ka go phadima la QUANTIFOIL 1.2/1.3 (Agar Scientific, UK). Duša keriti ka 20°C le 60% ya monola wa go lekana ka 30 s, ke moka o e phumole e omile ka 3 s, gomme o e time ka gare ga ethane ya seela ka -176°C.
ya data ya RC-LH114-W rarahaneng ile rekotoa ka eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) le Titan Krios maekerosekopo, e sebetsang ka gagamalo potlakisa ya 300kV, le kgodiso ya lebitso ya 130,000 × le matla a- Kgetha sekgoba sa 20 eV. Gatan 968 GIF Quantum yeo e nago le sešuthi sa tlhōrō sa K2 e ile ya šomišwa go rekota diswantšho ka mokgwa wa go bala go kgoboketša datha. Bogolo bja dipiksele bjo bo lekantšwego ke 1.048Å, gomme seelo sa tekanyetšo ke 3.83 e-Å-2s-1. Kgoboketša filimi ka metsotswana e 11 gomme a e arola ka dikarolo tše 40. Diriša lefelo leo le tloditšwego ka khapone go tsepamiša maekerosekopo gape, ke moka o kgoboketše difilimi tše tharo ka moleteng. Ka kakaretšo, difilimi tše 3130 di ile tša kgoboketšwa, ka dikelo tša defocus magareng ga -1 le -3μm.
Datha ya RC-LH116 complex e kgobokeditšwe ka go šomiša maekerosekopo ye e swanago ka Asterbury Biostructure Laboratory (Yunibesithi ya Leeds, UK). ya data e ile ya kgoboketšwa ka mokgwa wa go bala ka go godiša ga 130 k, gomme bogolo bja dipiksele bo ile bja lekanywa go fihla go 1.065 Å ka tekanyetšo ya 4.6 e-Å-2s-1. Filimi e ile ya rekotwa ka metsotswana e 12 gomme ya arolwa ka dikarolo tše 48. Ka kakaretšo, difilimi tše 3359 di ile tša kgoboketšwa, ka dikelo tša defocus magareng ga -1 le -3μm.
Tshepedišo ka moka ya data e dirwa ka gare ga phaephe ya Relion 3.0 (42). Šomiša Motioncorr 2 (43) go lokiša tšhišinyego ya mahlaseli ka boima bja tekanyetšo, gomme ka morago o šomiše CTFFIND 4.1 (44) go laetša paramethara ya CTF (mošomo wa phetišetšo ya phapano). Difotomaekrokerafo tše di tlwaelegilego ka morago ga dikgato tše tša mathomo tša tshepedišo di bontšhitšwe mo Seswantšhong sa 2. S16. Thempleite ya kgetho ya go itiriša e tšweletšwa ka go kgetha ka seatla dipiksele tše ka bago tše 250 tša dikarolwana tše 1000 ka gare ga foreime ya dipiksele tše 250 gomme ga go na go hlopha ga tšhupetšo ya mahlakore a mabedi (2D), ka go realo go gana dihlopha tšeo di fihlelelago tšhilafatšo ya sampole goba tšeo di se nago dimelo tše di lemogegago. Ka morago, kgetho ya go itiriša e ile ya dirwa go di- microphotograph ka moka, gomme RC-LH114-W e be e le dikarolwana tše 849 359, gomme RC-LH116 complex e be e le dikarolwana tše 476 547. Dikarolwana ka moka tše di kgethilwego di fetile dipotologo tše pedi tša go hlopha ga 2D yeo e sego ya tšhupetšo, gomme ka morago ga go kitima go gongwe le go gongwe, dikarolwana tšeo di kopanago le lefelo la khapone, tšhilafalo ya sampole, ga go na dikarolo tše di lego molaleng goba dikarolwana tšeo di lekelelanago ka maatla di a ganwa, go feleletša ka 772,033 (90.9%) le 359,678 (75.5%) ) Dikarolwana di šomišwa go hlopha 3D ya RC-LH114-W le RC-LH116 ka go latelelana. Mohlala wa mathomo wa tšhupetšo wa 3D o ile wa tšweletšwa ka go šomiša mokgwa wa go theoga wa stochastic gradient. Ka go šomiša mohlala wa mathomo bjalo ka tšhupetšo, dikarolwana tše di kgethilwego di arotšwe ka magoro a mane ka go 3D. Using mohlala ka sehlopha sena e le tshupiso, phetha 3D hloekisa ka dikarolwana ka sehlopha se seholo ka ho fetisisa, ebe sebelisa qalong 15Å tlaase-feta filtara ho koahela sebakeng sa solvent, eketsa 6 dipiksele tsa metshetshe bonolo, 'me post-tshebetso dipiksele ho lokisa Gatan K2 tlhōrō Modulation phetiso mosebetsi oa holimo detector. Bakeng sa RC-LH114-W dataset, mohlala ona wa mathomo o ile wa fetošwa ka go tloša segokanyipalo se matla ka metshetshe ya mask (e kgaotšwe go tšwa go segokanyipalo sa motheo se se raraganego ka go UCSF Chimera). The dikai sephetho le (diphetho tsa RC-LH114-W le RC-LH116 ke 3.91 le 4.16 Å, ka ho latellana) di sebediswa e le tshupiso bakeng sa potoloho ea bobeli ea 3D classification. Dikarolwana tše di šomišitšwego di hlophilwe ka sehlopha sa mathomo sa 3D gomme ga di na tswalano ye maatla le baagišani. Go swana goba go hloka diponagalo tša sebopego tše di lego molaleng. Ka morago ga tikologo ya bobedi ya go hlopha ga 3D, sehlopha seo se nago le tharollo ye e phagamego kudu se ile sa kgethwa [Bakeng sa RC-LH114-W, legoro le tee ke dikarolwana tše 377,703 (44.5%), bakeng sa RC-LH116, go na le magoro a mabedi, ao a fihlago palomoka ya dikarolwana tše 260,752 (54.7%) , Moo di swanago fela ge di logaganywa ka morago ga go dikološa ga mathomo ka phapano ye nnyane]. Dikarolwana tše di kgethilwego di ntšhwa gape ka lepokising la dipiksele tše 400 gomme tša hlwekišwa ka go hlwekišwa ga 3D. The solvent mask e generated sebelisa qalong 15Å tlaase-feta filtara, 3 dipikselse 'mapa katoloso le 3 dipiksele bonolo maske. Ka go šomiša tlhwekišo ya CTF ka karolwana, phošollo ya tšhišinyego ya karolwana le tikologo ya bobedi ya tlhwekišo ya CTF ka karolwana, tlhwekišo ya 3D, go šira solvent le go šoma ka morago di dirwa ka morago ga kgato ye nngwe le ye nngwe go hlwekišwa gape sebopego seo se tšweletšwago. Ka go šomiša boleng bja go kgaola bja FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) bja 0.143, diphetho tša dika tša mafelelo tša RC-LH114-W le RC-LH116 ke 2.65 le 2.80Å, ka go latelelana. Koba ya FSC ya mohlala wa mafelelo e bontšhitšwe mo Seswantšhong sa 2. S17.
Tatelano ka moka ya diproteine ​​e taoneloutwa go tšwa go UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; ID ya UniProt: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID ya UniProt: O83005); RC-M (PufM; ID ya UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID ya UniProt: A0A4Z9); Proteine-W (PufW; ID ya UniProt: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) e ile ya šomišwa go aga mohlala wa homology wa RC, wo o nago le tatelano ya proteine ​​ya RC-L, RC-M le RC-H le sebopego sa kristale sa Rba. sphaeroides RC e ile ya šomišwa bjalo ka thempleite (PDB ID: 5LSE) (46). Diriša sedirišwa sa “go swanela mmapa” ka go UCSF Chimera go swanela mohlala wo o tšweleditšwego go mmapa (47), go kaonafatša sebopego sa proteine, le cofactor [4 × BChl a (leina la mašaledi a bokgobapuku bja monomer = BCL), 2 × BPh a (BPH), mohuta o tee goba tše pedi tša UQ10 (U10), tšhipi e tee yeo e sego ya heme (Fe) le e tee ya 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)] diriša Coot (48) go oketša. Ka ge QAK e sa hwetšagale bokgobapukung bja monomer, e ile ya parameterized ka go šomiša sedirišwa sa eLBOW ka go PHENIX ( 49 ).
Se se latelago, subunit ya LH1 e ile ya agwa. Mathomong, sedirišwa sa go aga sa go itiriša ka go PHENIX (49) se ile sa šomišwa go aga ka go itiriša karolo ya tatelano ya LH1 ka go šomiša mmapa le tatelano ya proteine ​​ya LH1-α le LH1-β bjalo ka tsenyo. Kgetha subunit ya LH1 ye e feletšego kudu, e ntšhe gomme o e laetše ka gare ga Coot, o tsenye ka seatla tatelano ye e hlaelelago go yona, gomme o hlwekiše sebopego ka moka ka seatla pele o oketša di-BCl tše pedi a (BCL) le spirilloxanthin (CRT) [go ya ka Rps tše di lebanego Kitlano ya LH1 complex le diteng tša carotenoid tše di tsebjago. Mehuta ya diphedi (17)]. Kopiša yuniti ya ka fasana ya LH1 ye e feletšego, gomme o šomiše UCSF Chimera “Docking Map Tool” go dock lefelong la kgauswi leo e sego la mohlala la segokanyipalo sa LH1, gomme ka morago o e hlwekiše ka Coot; pheta tshepedišo go fihlela diyuniti ka moka tša ka fasana tša LH1 di dirilwe mohlala. Bakeng sa sebopego sa RC-LH114-W, ka go ntšha segokanyipalo seo se sa abelwago ka gare ga Coot, proteine ​​e arotšwe go tšwa go dikarolo tše di šetšego tšeo e sego tša proteine ​​ka mmapeng wa USCF Chimera gomme sedirišwa sa Autobuild se šomišwa go hloma mohlala wa mathomo, le diyuniti tše nnyane tše di šetšego (protein-W) Modeling. Mo go PHENIX (49). Oketša tatelano efe goba efe ye e hlaelelago go mohlala wo o tšweletšwago go Coot (48), gomme ka morago o hlwekiše ka seatla yuniti ka moka ya ka fasana. Segokanyipalo se se šetšego seo se sa abelwago se swanetše motswako wa dilipid (ID ya bokgobapuku bja monomer ya PDB ya CDL = CDL, POPC = 6PL le POPG = PGT), sehlatswa sa β-DDM (LMT) le dimolekule tša UQ10 (U10). Diriša PHENIX optimization (49) le pukwanana optimization ka Coot (48) ho phethagatša mohlala wa mathomo ka botlalo go fihlela dipalopalo tša mohlala le boleng bja pono bja go swanela di ka se kaonefatšwe gape. Mafelelong, šomiša LocScale (50) go loutša mmapa wa selegae, gomme ka morago o dire medikologo ye mengwe ye mmalwa ya go dira mohlala wa segokanyipalo seo se sa abelwago le go dira gore go šome gabotse ka go itiriša le ka seatla.
Dipeptide ka go latelana, di-cofactor le di-lipid tše dingwe le di-quinone tšeo di emišitšwego ka gare ga di-density tša tšona ka go latelana di bontšhitšwe go Ditshwantšho 1 le 2. S18 go ya go S23. Tshedimošo ya dipalopalo ya mohlala wa mafelelo e bontšhitšwe go Lenaneo la S1.
Ntle le ge go laeditšwe ka tsela ye nngwe, dispektra tša go monya tša UV/Vis/NIR di kgobokeditšwe go spectrophotometer ya Cary60 (Agilent, USA) ka dikgao tša 1 nm go tloga go 250 nm go ya go 1000 nm le nako ya kopanyo ya 0.1s.
Hlatswa sampole ka gare ga cuvette ya quartz ka tsela ya 2 mm go ya go A880 ya 1, gomme o kgoboketše sepektheramo sa go monya magareng ga 400 le 1000 nm. Dispektra tša dichroic tša nkgokolo di ile tša kgoboketšwa ka spectropolarimeter ya Jasco 810 (Jasco, Japane) ka dikgao tša 1 nm magareng ga 400 nm le 950 nm ka seelo sa skena sa 20 nm min-1.
Segokanyipalo sa go fedišwa ga molar se laolwa ka go hlatswa se raraganego sa motheo go fihla go A880 ya go ka ba 50. Hlatswa bophagamo bja 10μl ka gare ga 990μl ya go tlama buffer goba methanol, gomme o kgoboketše sepektheramo sa go monya ka pela go fokotša go senyega ga BChl. Diteng tša BChl tša sampole ye nngwe le ye nngwe ya methanol di ile tša balwa ka segokanyipalo sa go fedišwa ka 771 nm ya 54.8 mM-1 cm-1, gomme segokanyipalo sa go fedišwa se ile sa ikemišetša (51). Arola mahloriso a BChl a lekantšwego ka 32 (RC-LH114-W) goba 36 (RC-LH116) go bona mahloriso a raraganego a motheo, ao ka morago a šomišwago go laetša sepektheramo sa go monya sa sampole ye e swanago yeo e kgobokeditšwego ka gare ga segokanyipalo sa go fedišwa sa buffer. bapelana. Ditekanyo tše tharo tše di boeleditšwego di ile tša tšewa bakeng sa sampole ye nngwe le ye nngwe, gomme palogare ya go monya ya palomoka ya BChl Qy e ile ya šomišwa go bala. Segokanyipalo sa go fedišwa sa RC-LH114-W seo se lekantšwego ka 878 nm ke 3280±140 mM-1 cm-1, mola segokanyipalo sa go fedišwa sa RC-LH116 seo se lekantšwego ka 880 nm e le 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 e ile ya balwa ka bontši go ya ka mokgwa wa go (52). Ka boripana, HPLC ya kgato ya go bušetša morago (RP-HPLC) e dirilwe ka go šomiša tshepedišo ya Agilent 1200 HPLC. Qhibidiša mo e ka bago 0.02 nmol ya RC-LH116 goba RC-LH114-W ka gare ga 50μl ya 50:50 methanol:chloroform yeo e nago le 0.02% (w/v) ya ferric chloride, gomme o hlabe Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm yeo e lekalekanego pele ka gare ga 1 ml-1 min-1 ka 40°C ka HPLC solvent (80: 20 methanol: 2-propanol) ka kholomo ya × 25 cm. Dira elution ya isocratic ka gare ga solvent ya HPLC go hlokomela absorbance ka 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) le 780 nm (BChl) ka iri ye 1. Tlhora ya chromatogram ya 275 nm ka metsotso ye 25.5 e ile ya kopanywa, yeo e bego e se na metswako ye mengwe ye e lemogegago. Lefelo le le kopantšwego le šomišwa go bala palo ya molar ya UQ10 yeo e ntšhitšwego ka go šupa go koba ya go lekanya yeo e balwago go tšwa go ente ya maemo a hlwekilego go tšwa go 0 go ya go 5.8 nmol (Setshwantšho S14). Sampole ye nngwe le ye nngwe e ile ya sekaseka ka diphetolelo tše tharo, gomme phošo ye e begilwego e sepelelana le SD ya palogare.
Tharollo ye e nago le RC-LH1 complex yeo e nago le palomoka ya go monya Qy ya 0.1 e ile ya lokišetšwa ka 30 μM ye e fokoditšwego ya cytochrome ya pelo ya pere c2 (Merck, UK) le 0 go ya go 50 μMUQ2 (Merck, UK). Disampole tše tharo tša 1-ml di ile tša lokišetšwa ka kgatelelo ye nngwe le ye nngwe ya UQ2 gomme tša bjalwa bošego ka moka leswiswing ka 4°C go netefatša go tlwaelana ka botlalo lefsifsing pele ga go ela. Tharollo e ile ya imelwa ka gare ga OLIS RSM1000 modular spectrophotometer yeo e nago le 300 nm kgabo/500 line grating, 1.24 mm inlet, 0.12 mm bogareng le 0.6 mm outlet slits. Sefa ya go feta ya botelele bja 600 nm e bewa mojakong wa phototube ya mohlala le tube ya photomultiplier ya tšhupetšo go kgapeletša ntle seetša sa go hlohleletša. Absorbance e ile ya hlokomelwa ka 550 nm ka nako ya kopanyo ya 0.15 s. Leseli la go tsoša le ntšhwa go tšwa go 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) ka thapo ya faeba ya optic ka maatla a 90% ka molaodi wa DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) gomme e ntšhwa mohloding wa seetša ka khutlo ya 90° ya. Mahlasedi a go ela a kgahlanong le seipone go bušetša seetša sefe goba sefe seo mathomong se bego se sa monywa ke sampole. Hlokomela absorbance 10 s pele ho khanya ha 50 s. Ka morago ga moo go monya go ile gwa hlokomelwa gape ka 60 s leswiswing go hlahloba tekanyo yeo quinolol e fokotšago ka go itiragalela cytochrome c23 + (bona Seswantšho S8 bakeng sa datha ye tala).
Datha e ile ya šongwa ka go lokela seelo sa mathomo sa linear ka gare ga 0.5 go ya go 10 s (go ya ka mahloriso a UQ2) le go arola ka palogare ya ditekanyo tša disampole ka moka tše tharo ka mahloriso a mangwe le a mangwe a UQ2. Mahloriso a RC-LH1 ao a balwago ke segokanyipalo sa go fedišwa ka go latelana a šomišitšwe go fetolela seelo go bokgoni bja catalytic, seo se thadilwego ka go Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), gomme sa lokeletšwa go mohlala wa Michaelis-Menten go laetša dikelo tše di bonagalago tša Km le Kcat.
Bakeng sa ditekanyo tša go monya tša nakwana, sampole ya RC-LH1 e ile ya hlapološwa go fihla go ~ 2μM ka gare ga buffer ya IMAC yeo e nago le 50 mM sodium ascorbate (Merck, USA) le 0.4 mM Terbutin (Merck, USA). Esiti ya ascorbic e šomišwa bjalo ka moabi wa dielektherone wa sehlabelo, gomme tert-butaclofen e šomišwa bjalo ka thibela ya QB go netefatša gore moabi yo mogolo wa RC o dula a fokotšegile (ke gore, e sego photooxidized) tshepedišong ka moka ya go ela. Mo e ka bago 3 ml ya sampole e tlaleletšwa go sele ya go dikološa ya tlwaelo (e ka bago 0.1 m ka bophara, 350 RPM) ka botelele bja tsela ya optical ya 2 mm go netefatša gore sampole yeo e lego tseleng ya laser e na le nako ye e lekanego ya go tlwaelana le lefsifsi magareng ga di-pulse tša go hlohleletša. Sebelisa ~ 100-fs tham mong bang laser pulses ho amplify Ti: Sapphire tham mong bang laser tsamaiso (Spectra Physics, USA) ho thabisa sampole ka 880 nm ka sekhahla pheta-pheta ea 1 kHz (20 nJ bakeng sa NIR kapa 100 nJ bakeng sa Vis). Pele o kgoboketša ya data, pepentšha sampole seetšeng sa go hlohleletša ka metsotso ye e ka bago ye 30. Go pepentšhwa go tla hlola go se šome ga QA (mohlomongwe go fokotša QA gatee goba gabedi). Eupša hle ela hloko gore tshepedišo ye e a bušetšwa morago ka gobane ka morago ga nako ye telele ya go tlwaelana ga leswiswi, RC e tla boela morago ganyenyane-ganyenyane mošomong wa QA. Sepektherometer sa Helios (Ultrafast Systems, USA) se ile sa šomišwa go ela dispektra tša nakwana ka nako ya go diega ya -10 go ya go 7000 ps . Diriša softwere ya Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) go aroganya disete tša datha, ke moka o kopanye le go dira gore e be ya maemo. Diriša sephuthelwana sa softwere sa CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) go šomiša sete ya datha ye e kopantšwego go hwetša dispektra tša phapano tšeo di amanago le go bola, goba o šomiše mošomo wo o kgokološago ditšhupetšo tše ntši le karabelo ya sedirišwa go swanela tlhagelelo ya spektra ya botelele bja maphoto a tee ka Tšwago (OriginLab, USA).
Bjalo ka ge go boletšwe ka mo godimo (53), filimi ya photosynthetic yeo e nago le LH1 complex yeo e hlokago bobedi RC le eriele ya LH2 ya pheriferale e ile ya lokišetšwa. Lera le ile la hlapološwa ka gare ga 20 mM tris (pH 8.0) gomme ka morago la imelwa ka gare ga cuvette ya quartz ka tsela ya optical ya 2 mm. Pulse ya laser ya 30nJ e ile ya šomišwa go tsoša sampole ka 540 nm ka nako ya go diega ya -10 go ya go 7000 ps. Tshepedišo ya data sete bjalo ka ge e hlalošitšwe bakeng sa Rps. pal sampole.
Lera le ile la pelleted ka centrifugation ka 150,000 RCF ka diiri tše 2 ka 4°C, gomme ka morago ga moo go monya ga lona ka 880 nm go ile gwa emišwa gape ka gare ga 20 mM tris-HCl (pH 8.0) le 200 mM NaCl. Hlakola lera ka go hlohleletša ka go nanya ka gare ga 2% (w/v) β-DDM ka iri ye 1 leswiswing ka 4°C. Sampole e ile ya hlapološwa ka gare ga 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) go fihla go mahloriso a proteine ​​ya 2.5 mg ml-1 (tshekatsheko ya Bio-Rad). Tshepetšo ye nngwe e dirilwe go tšwa go mokgwa wo o phatlaladitšwego peleng (54), go thoma ka go hlatswa ga proteine ​​ya 50 μg go palomoka ya 50 μl ya TEAB yeo e nago le 1% (w/v) sodium laurate (Merck, UK). Ka morago ga sonication ka 60 s, e ile ya fokotšwa ka 5 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine (Merck, UK) ka 37 ° C ka metsotso e 30. Bakeng sa S-alkylation, duša sampole ka 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) gomme o e tsenye go tšwa go tharollo ya setoko sa 200 mM isopropanol metsotso ye 10 ka themperetšheng ya phapoši. Tšhilo ya dijo ya proteolytic e dirilwe ka go oketša 2 μg ya motswako wa trypsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) gomme ya bjalwa ka 37°C ka diiri tše 3. Sedirišwa sa go šoma godimo ga laurate se ile sa ntšhwa ka go tlaleletša ka 50 μl ya ethyl acetate le 10 μl ya 10% (v/v) ya LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) le go vortexing ka 60 s. Karoganyo ya kgato e ile ya kgothaletšwa ka centrifugation ka 15,700 RCF ka metsotso ye 5. Go ya ka protocol ya motšweletši, kholomo ya go dikološa ya C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) e ile ya šomišwa go aspirate le go tloša letswai ka kelohloko kgato ya ka fase yeo e nago le peptide. Ka morago ga go omiša ka centrifugation ya lefeela, sampole e ile ya hlapološwa ka gare ga 0.5% TFA le 3% acetonitrile, gomme 500 ng e ile ya sekaseka ka nanoflow RP chromatography yeo e kopantšwego le spectrometry ya boima ka go šomiša ditekanyetšo tša tshepedišo tšeo di hlalošitšwego ka botlalo peleng.
Šomiša MaxQuant v.1.5.3.30 (56) bakeng sa go hlaola proteine ​​le go ela boleng go nyaka Rps. polokelo ya tshedimošo ya proteome ya palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Datha ya proteomics ya spectrometry ya boima e beilwe ka go ProteomeXchange Alliance ka polokelo ya molekane wa PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ka fase ga sešupo sa dataset PXD020402.
Bakeng sa and analysis ka RPLC kopantswe le electrospray ionization boima spectrometry, RC-LH1 rarahaneng ile lokisetsa ho tloha hlaha-mofuta Rps. Ka go šomiša mokgwa wo o phatlaladitšwego peleng (16), mahloriso a proteine ​​ao a tšweleditšwego ka diseleng tša palustris e be e le 2 mg ml-1 ka gare ga 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl le 0.03% (w/v) β- (tshekatsheko ya Bio-Rad) ) DDM. Go ya ka protocol ya motšweletši, šomiša 2D purification kit (GE Healthcare, USA) go ntšha 10 μg ya proteine ​​ka mokgwa wa pula, gomme o hlapološe pula ka gare ga 20 μl 60% (v / v) formic acid (FA), 20% (v / v) Acetonitrile le 20% (v/v) meetse. Di-microliter tše hlano di ile tša hlahlobja ka RPLC (Dionex RSLC) yeo e kopantšwego le spectrometry ya boima (Maxis UHR-TOF, Bruker). Diriša kholomo ya MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) bakeng sa karoganyo ka 60°C le 100μlmin -1, ka gradient ya 85% (v / v) solvent A [0.1% (v / v) FA le 0.02% (V/v) TFA tharollo ya meetse] go ya go 85%(v/v) solvent B [0.1% (v / v) FA le 0.02% (v / v) ka 90% (v / v) acetonitrile TFA] Ka ho sebelisa maemo a electrospray ionization mohloli le default ditekanyetos bakeng sa metsotso e fetang 60, boima spectrometer fumana 100 ho 2750 m / z (boima-ho-tefiso karo-karolelano). Ka thušo ya ExPASy bioinformatics mohlodi kgoro FindPept sedirišwa (https://web.expasy.org/findpept/), mmapa sepektheremo boima go diyuniti tše nnyane tša raraganego.
Disele di ile tša bjalwa diiri tše 72 ka fase ga 100 ml ya NF-tlase (10μMm-2 s-1), ya magareng (30μMm-2 s-1) goba ya godimo (300μMm-2 s-1) ya seetša. Sedirišwa sa M22 (sedirišwa sa M22 seo go sona ammonium sulfate e tlogetšwego gomme sodium succinate e tšeetšwe legato ke sodium acetate) ka gare ga lebotlelo la 100 ml la sekurufu-godimo (23). Ka didikologa tše hlano tša 30-s, dipheta tša galase tša 0.1 micron di ile tša beaded ka tekanyo ya bophagamo bja 1:1 go lyse disele gomme tša tsidifatšwa godimo ga leqhwa ka metsotso ye 5. Taba ye e sa qhibidigego, disele tše di sa robegago le dipheta tša galase di ile tša tlošwa ka centrifugation ka 16,000 RCF ka metsotso ye 10 ka gare ga microcentrifuge ya benchtop. Lera le ile la arolwa ka gare ga rotor ya Ti 70.1 ka 100,000 RCF ka gare ga 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ka 40/15% (w/w) ya sucrose gradient ka diiri tše 10.
Bjalo ka ge go hlalositšwe mošomong wa rena wa peleng, immunodetection ya tag ya His go PufW (16). Ka bokhutšoanyane, e hloekisitsoeng konokono rarahaneng (11.8 nM) kapa lera le nang le mahloriso a tšoanang a RC (e ikemiseditse ka oxidation tlosa fokotswa phapang sepekere le ho tšoanang mojaro ka gel stained) ka 2x SDS loading buffer (Merck, UK) diluted habeli. Diprotheine di ile tša arolwa ka kopi ya 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). Gel e ile ya šilafatšwa ka Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) go laetša le go bona ka leihlo la kgopolo subunit ya RC-L. Proteine ​​yeo e lego godimo ga gel ya bobedi e ile ya fetišetšwa go lera la polyvinylidene fluoride (PVDF) leo le šomišitšwego ke methanol (Thermo Fisher Scientific, UK) bakeng sa tshekatsheko ya masole a mmele. Lera la PVDF le ile la thibelwa ka gare ga 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 le 5% (w / v) ya phofo ya maswi a go se be le makhura, gomme ka morago ya bjalwa ka anti-His primary antibody (ka Dilute the antibody buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl le 0.05% (v/v) Tween-20] ka 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) ka diiri tše 4. Ka morago ga go hlatswa ka makga a 3 ka metsotso ye 5 ka gare ga buffer ya dithibela-maikwelo, lera le ile la kopanywa le horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, UK) anti-mouse secondary antibody (e hlapolotšwego ka 1:10,000 ka gare ga buffer ya antibody) Duša go dumelela go utolla (metsotso ye 5 ka morago ga go hlatswiwa ga 3 ka gare ga buffer ya antibody) ka go šomiša WESTAR ETA C 2.0 chemiluminescence substrate (Cyanagen, Italy) le Amersham Imager 600 (GE Tlhokomelo ya Maphelo, UK).
Ka go thala kabo ya maatla a gel ye nngwe le ye nngwe ye e nago le letheba goba tsela ya immunoassay, go kopanya lefelo ka fase ga tlhora le go bala karolelano ya maatla a RC-L (gel ye e nago le letheba) le Protein-W (immunoassay), go ImageJ (57) Process the image. Ditekanyo tše di ile tša fetošetšwa go dikarolwana tša molar ka go tšea gore tekanyo ya RC-L go proteine-W ka sampole ye e hlwekilego ya RC-LH114-W e be e le 1:1 le go tlwaetša sete ka moka ya datha ka go swanela.
Bakeng sa didirišwa tša tlaleletšo tša sehlogo se, hle bona http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Ye ke sengwalwa sa phihlelelo ye e bulegilego seo se phatlalatšwago ka fase ga dipeelano tša Laesense ya Tlhagišo ya Creative Commons. Sehlogo se dumelela tšhomišo ye e sa thibelwego, kabo le go tšweletšwa gape ka sedirišwa le ge e le sefe ka fase ga maemo a gore mošomo wa mathomo o tsopotšwe gabotse.
Ela hloko: Re go kgopela fela gore o nee aterese ya gago ya imeile gore motho yo o mo kgothaletšago letlakaleng a tsebe gore o nyaka gore a bone imeile yeo le gore ga se spam. Re ka se thope diaterese tša imeile dife goba dife.
Potšišo ye e šomišwa go leka ge eba o moeti le go thibela go romela ga spam ka go itiriša.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jakson, Kaitlyn M. Faries, D ariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, Dafida A. Molemi, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Sebopego sa tharollo ya godimo sa raraganego sa sefero sa seetša 1 setsi sa karabelo se fa temogo ye mpsha ka ga mafolofolo a quinone.
David J. K. Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jakson, Kaitlyn M. Faries, D ariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, Dafida A. Molemi, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Sebopego sa tharollo ya godimo sa raraganego sa sefero sa seetša 1 setsi sa karabelo se fa temogo ye mpsha ka ga mafolofolo a quinone.
©2021 Mokgatlo wa Amerika wa Tšwetšopele ya Saense. ditokelo tsohle di sireleditswe. AAAS ke molekane wa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef le COUNTER. Kgatelopele ya Mahlale ISSN 2375-2548.