Bjale *Aterese ya bjale: Cologne 50931, Jeremane, Cologne Dinyakišišo tša Sehlopha sa Bokgoni ka ga Karabelo ya Kgateletšego ya Disele malwetšing ao a amanago le Botšofadi (CECAD).
Go senyega ga ditšhika ga malwetši a mitochondrial go lebelelwa e le mo go sa fetogego ka gobane polasetiki ya metaboliki ya di- neuron e lekanyeditšwe, eupša mafelelo a go se šome gabotse ga mitochondria go boipušo bja sele ya metabolism ya di- neuron mmeleng ga a kwešišwe gabotse. Mo, re tsebagatša proteome ye e itšego ya sele ya di-neuron tša Purkinje ka tlhaelelo ya OXPHOS ye e tšwelago pele yeo e hlolwago ke mafolofolo a go kopanywa ga mitochondrial ao a šitišitšwego. Re hweditše gore go se šome gabotse ga mitochondrial go hlohleleditše phetogo ye kgolo lefapheng la proteomics, mafelelong go lebiša go tsenyweng tirišong ka tatelano ga mananeo a nepagetšego a metaboliki pele ga lehu la sele. Ka mo go sa letelwago, re ile ra ikemišetša go hlohleletša mo go lego molaleng ga pyruvate carboxylase (PCx) le di-peroxidase tše dingwe tšeo di amanago le go tlaleletša di-intermediate tša modikologo wa TCA. Thibelo ya PCx e ile ya gakatša kgateletšego ya oxidative le go senyega ga ditšhika, e lego seo se bontšhago gore atherosclerosis e na le mafelelo a tšhireletšo go di-neuron tšeo di hlokago OXPHOS. Go tsošološwa ga go kopanywa ga mitochondrial ka di- neuron tšeo di senyegilego mafelelong go bušetša morago ka mo go feletšego dimelo tše tša metaboliki, ka go rialo go thibela lehu la disele. Diphetho tša rena di hlaola ditsela tšeo di bego di sa tsebje pele tšeo di neago go kgotlelela go se šome gabotse ga mitochondrial gomme di bontšha gore go senyega ga ditšhika go ka bušetšwa morago gaešita le mogatong wa morago wa bolwetši.
Karolo e bohlokwa ya mitochondria go bolokeng metabolism ya matla a di- neuron e gatelelwa ke dika tše di nabilego tša methapo tšeo di sepedišanago le malwetši a mitochondria a batho. Bontši bja malwetši a a bakwa ke diphetogo tša dikarolwana tša leabela tšeo di laolago polelo ya dikarolwana tša leabela tša mitochondrial (1, 2) goba tshenyo ya dikarolwana tša leabela tšeo di amanago le mafolofolo a mitochondrial, tšeo di amago ka mo go sa lebanyego go tsepama ga DNA ya mitochondrial (mtDNA) (3, 4). Mošomo dikaong tša diphoofolo o bontšhitše gore go arabela go se šome gabotse ga mitochondrial ditlhalenama tše di dikologilego, ditsela tša metaboliki tše di bolokago (5-7) di ka šomišwa, ka go realo di fa temogo ya bohlokwa ka ga pathogenesis ya malwetši a a raraganego. Ka mo go fapanego kudu, kwešišo ya rena ya diphetogo tša metaboliki tša mehuta e itšego ya disele tšeo di bakwago ke go palelwa ka kakaretšo ga tšweletšo ya mitochondrial adenosine triphosphate (ATP) ya bjoko ke ya motheo (8), e gatelela go nyakega ga go hlaola diphetho tša kalafo tšeo di ka dirišetšwago go thibela goba go thibela bolwetši. Thibela go senyega ga ditšhika (9). Go hloka tsebišo ke taba ya gore disele tša methapo di lebelelwa ka mo go apareditšego e le tšeo di nago le go feto-fetoga mo go lekanyeditšwego kudu ga metaboliki ge di bapetšwa le mehuta ya disele tša ditlhalenama tše di dikologilego ( 10 ). Ka ge disele tše di kgatha tema e bohlokwa go kgokaganyeng kabo ya di- metabolite go di- neuron go kgothaletša phetišetšo ya synaptic le go arabela maemong a dikgobalo le bolwetši, bokgoni bja go tlwaetša metabolism ya disele go ya ka maemo a hlohlago a dinama tša bjoko bo nyakile bo lekanyeditšwe go disele tša glial ( 11-14 ). Go oketša moo, go se swane ga tlhago ga disele ga ditlhalenama tša bjoko go šitiša kudu thuto ya diphetogo tša metaboliki tšeo di diregago dihlopheng tše dinyenyane tše itšego tša di- neuron. Ka baka leo, ga go tsebje mo gontši ka ditla-morago tše di nepagetšego tša disele le tša metaboliki tša go se šome gabotse ga mitochondrial di- neuron.
E le gore re kwešiše ditlamorago tša metaboliki tša go se šome gabotse ga mitochondrial, re ile ra arola di-neuron tša Purkinje (PNs) ka dikgatong tše di fapanego tša go senyega ga ditšhika tšeo di bakilwego ke tshenyo ya go kopanywa ga lera la ka ntle la mitochondrial (Mfn2). Le ge e le gore diphetogo tša leabela tša Mfn2 bathong di tswalanywa le mokgwa wa neuropathy ya dikwi ya go sepela ya leabela yeo e tsebjago bjalo ka Charcot-Marie-Tooth type 2A (15), tshenyo ya maemo ya Mfn2 ka dipeba ke induction yeo e lemogwago gabotse ya mokgwa wa go se šome gabotse wa oxidation Phosphorylation (OXPHOS). The mefuta e fapaneng neuronal subtypes (16-19) le sephetho le neurodegenerative phenotype di tsamaea le matšoao a tsoelang pele methapo, tse kang mafu a motsamao (18, 19) kapa cerebellar ataxia (16). Ka go šomiša motswako wa proteomics ya boleng bjo bo se nago leina (LFQ), metabolomics, go tšea diswantšho, le mekgwa ya virological, re bontšha gore go senyega ga ditšhika mo go tšwelago pele go hlohleletša ka maatla pyruvate carboxylase (PCx) le mabaka a mangwe ao a amegago go arteriosclerosis ya di-PN ka vivo Polelo ya diensaeme. Go netefatša go swanela ga sephetho se, re ile ra laola ka go lebanya polelo ya PCx ka go di-PN tšeo di hlaelelago Mfn2, gomme ra hwetša gore tshepedišo ye e gakaditše kgateletšego ya oxidative le go akgofiša go senyega ga ditšhika, ka go realo ra hlatsela gore azoospermia e fa lehu la sele Go fetofetoga ga metaboliki. Polelo e šoro ya MFN2 e ka phološa ka mo go feletšego PN ya go senyega ga mafelelo ka tlhaelelo e šoro ya OXPHOS, tšhomišo e kgolo ya DNA ya mitochondrial, le go bonagala e robegile netweke ya mitochondrial, yeo e gatelelago gape gore mokgwa wo wa go senyega ga ditšhika o ka ba wa fola mogatong o tšwetšego pele wa bolwetši pele ga lehu la sele.
E le hore ho bona ka leihlo la kgopolo mitochondria ka Mfn2 knockout PNs, re ile ra sebelisa mofuta oa toeba e lumellang Cre-itšetlehileng mitochondria ho nepisa mosehla fluorescent protheine (YFP) (mtYFP) (20) Cre polelo le hlahloba sebopeho mitochondrial ka vivo. Re hweditše gore tshenyo ya lephelo la Mfn2 ka go di-PN e be e tla lebiša go karoganyo ya ganyenyane-ganyenyane ya netweke ya mitochondrial (Setshwantšho S1A), gomme phetogo ya mathomo e hweditšwe ka dibeke tše 3 tša mengwaga. Ka go fapana, go senyega mo gogolo ga legato la sele ya PN, bjalo ka ge go hlatsetšwe ke tahlegelo ya Calbindin immunostaining, ga se ya thoma go fihla dibeke tše 12 tša mengwaga (Setshwantšho 1, A le B). Go se swane ga nako magareng ga diphetogo tša mathomo tša sebopego sa mitochondrial le go thoma mo go bonagalago ga lehu la di- neuron go ile gwa re tutueletša go nyakišiša diphetogo tša metaboliki tšeo di hlohleletšwago ke go se šome gabotse ga mitochondria pele ga lehu la sele. Re ile ra ntshetsa pele fluorescence-busoa sele hlophisa (FACS)-thehiloeng leano la ho arola YFP (YFP +)-bontša PN (Figure 1C), le ka taolo litoeba (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- ema-loxP: : L7-cre), hona ka mor'a moo e bitsoa CTRL (Figure S1B). The optimization ya gating leano thehiloeng ka matla a leloko la YFP pontšo e re lumella ho hloekisa YFP + 'mele (YFPhigh) ya PNs ho tloha bao e seng PNs (YFPneg) (Figure S1B) kapa putative fluorescent axon / dendritic dikarolwana (YFPlow; Figure S1D, le letšehali), netefalitsoeng ke confocal microscope (Figure S1D, ka ho le letona). E le gore re netefatše boitšhupo bja baagi bao ba arotšwego, re ile ra dira proteomics ya LFQ gomme ka morago ra dira tshekatsheko ya dikarolo tše kgolo, gomme ra hwetša gore go na le karogano ye e kwagalago magareng ga disele tša YFPhigh le YFPneg ( Seswantšho S1C ). Disele tša YFPhigh di bontšhitše go humišwa ga nete ya maswao a PNs a tsebjago (ke gore Calb1, Pcp2, Grid2 le Itpr3) (21, 22), eupša ga go na go humišwa ga diprotheine tšeo ka tlwaelo di bontšhwago ka gare ga di-neuron goba mehuta ye mengwe ya disele (Setshwantšho 1D) ). Papiso pakeng tsa disampole ka classified YFPhigh lisele tse bokella ka liteko ikemetseng bontšitse segokanyipalo kgokagano> 0.9, bontša molemo reproducibility pakeng tsa replicates thutaphedi (Figure S1E). Ka boripana, ya data ye e netefaditše leano la rena la go arolwa mo go hlobaetšago le mo go itšego ga PN ye e kgonegago. Ka lebaka la gore tshepedišo ya mootledi ya L7-cre yeo e šomišitšwego e hlohleletša kopanyo ya mosaic bekeng ya mathomo ka morago ga pelego (23), re ile ra thoma go bolaya dipeba go tšwa go CTRL le go ba le maemo (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Kgoboketša di-neuron. Ka morago ga ge go kopanywa gape go phethilwe, e bitšwa Mfn2cKO ka dibeke tše 4 tša bogolo. Bjalo ka ntlha ya mafelelo, re ile ra kgetha dibeke tše 8 tša mengwaga ge legato la PN le be le sa dutše le sa senyege go sa šetšwe dikarolwana tša mitochondrial tše di lego molaleng ( Seswantšho 1B le Seswantšho S1A ). Ka kakaretso, re quantified palo yohle ya 3013 diprotheine, tse ka bang 22% ba ne ba thehiloe MitoCarta 2.0 annotations thehiloeng mitochondrial proteome e le mitochondria (Figure 1E) (Figure 1E) (24). Tshekatsheko ya polelo ya dikarolwana tša leabela ya phapano yeo e dirilwego ka beke ya 8 e bontšhitše gore ke 10.5% fela ya diproteine ​​ka moka tšeo di nago le diphetogo tše bohlokwa (Setshwantšho 1F le Seswantšho S1F), tšeo diproteine ​​tše 195 di bego di laolwa fase gomme diproteine ​​tše 120 di be di laolwa godimo (Setshwantšho 1F). Ke mo go swanetšego go lemoga gore “tshekatsheko ya tsela ya boitlhamelo” ya sete ye ya datha e bontšha gore dikarolwana tša leabela tšeo di bontšhitšwego ka go fapana kudu ke tša sete ye e thibetšwego ya ditsela tše itšego tša metaboliki (Setshwantšho 1G). Se se kgahlišago ke gore le ge e le gore taolo ya fase ya ditsela tše di amanago le OXPHOS le go laetša khalsiamo e tiišetša go hlohleletša go se šome gabotse ga mitochondrial ka go di-PN tšeo di hlaelelago go kopanywa, magoro a mangwe ao a akaretšago kudu metabolism ya amino acid a laolwa godimo kudu, e lego seo se sepelelanago le metabolism yeo e diregago ka go di-PN tša mitochondrial. Rewiring e sa fetoge. go se šome gabotse.
(A) Dinepe tša confocal tša moemedi tša dikarolo tša cerebellar tša dipeba tša CTRL le Mfn2cKO tšeo di bontšhago tahlegelo ye e tšwelago pele ya di-PN (calbindin, bohlokwa); di-nucleus di be di counterstained ka DAPI. (B) Quantification ya (A) (tshekatsheko ya tsela e tee ya phapano, *** P <0.001; n = didiko tše 4 go ya go tše 6 go tšwa go dipeba tše tharo). (C) Tshepetšo ya mošomo ya diteko. (D) Kabo ya mmapa wa phišo ya maswao ao a itšego go Purkinje (ka godimo) le mehuta ye mengwe ya disele (gare). (E) Seswantšho sa Venn seo se bontšhago palo ya diprotheine tša mitochondrial tšeo di hlaotšwego ka go PN yeo e arotšwego. (F) Thaba-mollo plot ya differentially bontšitsoeng diprotheine ka Mfn2cKO neurons ka 8 dibeke (bohlokwa khaola-tima boleng ba 1.3). (G) Tshekatsheko ya tsela ya boitlhamelo e bontšha ditsela tše hlano tša bohlokwa kudu tša taolo ya godimo (ye khubedu) le ya taolo ya fase (botalalerata) ka go Mfn2cKO PN yeo e arotšwego bjalo ka dibeke tše 8. Palogare ya maemo a polelo ya proteine ​​ye nngwe le ye nngwe ye e lemogilwego e a bontšhwa. Grayscale mocheso 'mapa: fetotsoeng P boleng. ns, ga se bohlokwa.
Datha ya proteomics e bontšhitše gore polelo ya proteine ​​ya dikomponi tša I, III le IV e ile ya fokotšega ganyenyane-ganyenyane. Complexes I, III, le IV ka moka e be e na le diyuniti tše nnyane tše bohlokwa tšeo di ngwadilwego ka mtDNA, mola complex II, yeo e bego e na le khoutu ya nuclear fela, ge e le gabotse e be e sa amege ( Seswantšho 2A le Seswantšho S2A ). . Go sepelelana le dipoelo tša proteomics, immunohistochemistry ya dikarolo tša dinama tša cerebellar e bontšhitše gore maemo a MTCO1 (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) subunit ya maemo a raraganego IV ka PN a ile a fokotšega ganyenyane-ganyenyane (Figure 2B). The mtDNA-encoded subunit Mtatp8 ile haholo fokotsehile (Figure S2A), ha a ntse a tsitsitseng-boemo boemo ba nuclear-encoded ATP synthase subunit lula sa fetoha, e leng e lumellanang le tsejoa tsitsitseng ATP synthase subassembly F1 rarahaneng ha mtDNA polelo e tsitsitseng. Sebopego se a sa fetoge. Kgaotša (7). Tekolo ya maemo a mtDNA ka go di-PN tša Mfn2cKO tše di hlophišitšwego ka karabelo ya ketane ya polymerase ya nako ya nnete (qPCR) e tiišeditše go fokotšega ga palo ya khopi ya mtDNA ganyenyane-ganyenyane. Ge go bapetšwa le sehlopha sa taolo, ka dibeke tše 8 tša mengwaga, ke fela mo e ka bago 20% ya maemo a mtDNA E ile ya bolokwa (Setshwantšho 2C). Go sepelelana le dipoelo tše, go tšhilafatšwa ga microscopy ya confocal ya di-PN tša Mfn2cKO go utolla DNA go bontšha tšhomišo yeo e ithekgilego ka nako ya di-nucleotide tša mitochondrial ( Seswantšho 2D ). Re hweditše gore ke bonkgetheng ba bangwe fela bao ba amegago go senyegeng ga proteine ​​ya mitochondrial le karabelo ya kgateletšego bao ba bego ba laolwa godimo, go akaretšwa Lonp1, Afg3l2 le Clpx, le mabaka a kopano a raraganego a OXPHOS. Ga go na diphetogo tše bohlokwa maemong a diproteine ​​tšeo di akaretšwago go apoptosis tšeo di lemogilwego (Setshwantšho S2B). Ka mo go swanago, re hweditše gore dikanale tša mitochondria le endoplasmic reticulum tšeo di akaretšwago go dinamelwa tša khalsiamo di na le diphetogo tše nnyane fela (Setshwantšho S2C). Go tlaleletša, kelo ya diprotheine tše di amanago le autophagy ga se ya hwetša diphetogo tše bohlokwa, tšeo di sepelelanago le induction ye e bonagalago ya di-autophagosomes yeo e hlokometšwego ka vivo ka immunohistochemistry le microscopy ya elektrone ( Seswantšho S3 ). Le ge go le bjalo, go se šome gabotse ga OXPHOS mo go tšwelago pele ka go di-PN go sepedišana le diphetogo tše di lego molaleng tša mitochondrial tša ultrastructural. Dihlopha tša mitochondrial di ka bonwa ka mebeleng ya disele le mehlareng ya dendritic ya di-PN tša Mfn2cKO tša dibeke tše 5 le tše 8, gomme sebopego sa lera la ka gare se fetile diphetogo tše di tseneletšego (Setshwantšho S4, A le B). Go sepelelana le diphetogo tše tša ultrastructural le go fokotšega mo gogolo ga mtDNA, tshekatsheko ya dilae tša cerebellar tša cerebellar tše di hlobaetšago ka tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) e bontšhitše gore bokgoni bja lera la mitochondrial ka go Mfn2cKO PNs bo ile bja fokotšega kudu (Figure S4C).
(A) Nako thuto and analysis ya maemo a polelo ya OXPHOS rarahaneng. Ela hloko fela diprotheine tšeo di nago le P <0.05 ka dibeke tše 8 (ANOVA ya ditsela tše pedi). Mola wa marontho: Ga go na peakanyo ge e bapetšwa le CTRL. (B) Ka go le letshadi: Mohlala wa karolo ya cerebellar yeo e ngwadilwego ka anti-MTCO1 antibody (scale bar, 20 μm). Lefelo leo le tšerwego ke mebele ya disele tša Purkinje le khupeditšwe ke boserolane. Ka go le letona: Quantification ya maemo a MTCO1 (tshekatsheko ya tsela e tee ya phapano; n = 7 go ya go disele tše 20 tšeo di sekasekilwego go tšwa go dipeba tše tharo). (C) qPCR and analysis ya mtDNA khopi palo ka hlophisitsoeng PN (tsela e le 'ngoe and analysis ya phapang; n = 3 ho 7 litoeba). (D) Ka go le letshadi: Mohlala wa selae sa cerebellar seo se ngwadilwego ka anti-DNA antibody (scale bar, 20 μm). Lefelo leo le tšerwego ke mebele ya disele tša Purkinje le khupeditšwe ke boserolane. Ka go le letona: Quantification ya dišo tša mtDNA (tshekatsheko ya tsela e tee ya phapano; n = 5 go ya go disele tše 9 go tšwa go dipeba tše tharo). (E) Mohlala wa karolo ya cerebellar ye e hlobaetšago yeo e bontšhago disele tša mitoYFP + Purkinje (motsu) ka gare ga rekoto ya clamp ya patch ya sele ka moka. (F) Boleng bja IV curve. (G) Direkoto tša moemedi wa ente ya bjale ya depolarizing ka diseleng tša CTRL le Mfn2cKO Purkinje. Top trace: Puse ya mathomo yeo e hlohleleditšego AP. Bottom latedisa: Palo e kahodimodimo AP maqhubu a. (H) Boleng bja ditseno tša go itiragalela tša postsynaptic (sPSPs). Moemedi wa go rekota mohlala le tekanyo ya yona ya go godiša di bontšhitšwe go (I). Tshekatsheko ya tsela e tee ya phapano e seka-sekile n = 5 go ya go disele tše 20 go tšwa go dipeba tše tharo. Data di bontšhwa bjalo ka magareng±SEM; * P < 0.05 ; ** P < 0.01 ; *** P < 0.001 ya go tšhungwa. (J) Mehlala ya moemedi ya AP ya go itiragalela yeo e ngwadilwego ka go šomiša mokgwa wa clamp wa patch ye e phunyeleditšwego. Top latedisa: Palo e kahodimodimo AP maqhubu a. Bottom latedisa: zoom ya AP e le 'ngoe. (K) Bontša palogare le palo e kahodimodimo AP maqhubu a ho ea ka (J). Teko ya Mann-Whitney; n = 5 disele di ile tša sekaseka go tšwa go dipeba tše nne. Data di bontšhwa bjalo ka magareng±SEM; ga se bohlokwa.
Tshenyo ye e lego molaleng ya OXPHOS e ile ya lemogwa ka go Mfn2cKO PN ya dibeke tše 8, e laetša gore mošomo wa fisioloji wa di-neuron ga o tlwaelega kudu. Ka hona, re ile ra sekaseka litšobotsi tsa motlakase tse sa sebetseng tsa di-neuron tšeo di hlaelelago OXPHOS ka dibeke tše 4 go ya go tše 5 le dibeke tše 7 go ya go tše 8 ka go dira direkhoto tša clamp ya disele ka moka ka gare ga dilae tša cerebellar tše di hlobaetšago ( Seswantšho 2E ). Ka mo go sa letelwago, bokgoni bja lera la go khutša le karolelano le go ganetša go tsenya ga di-neuron tša Mfn2cKO di be di swana le taolo, le ge go be go e-na le diphapano tše di sa lemogegego magareng ga disele ( Lenaneo 1 ). Ka mo go swanago, ka dibeke tše 4 go ya go tše 5 tša mengwaga, ga go na diphetogo tše bohlokwa kamanong ya bjale-gagamalo (IV curve) tšeo di hweditšwego (Setshwantšho 2F). Le ge go le bjalo, ga go na di-neuron tša Mfn2cKO tša dibeke tše 7 go ya go tše 8 tšeo di phologilego mokgwa wa IV (mogato wa hyperpolarization), e laetša gore go na le go kwagala mo go kwagalago go bokgoni bja hyperpolarization mogatong wo wa morago. Ka go fapana, ka go di-neuron tša Mfn2cKO, maphoto a depolarizing ao a hlolago go tšhollwa ga bokgoni bja tiro bjo bo ipoeletšago (AP) a kgotlelelwa gabotse, e laetša gore dipaterone tša bona tša go tšhollwa ka kakaretšo ga di fapane kudu le tša di-neuron tša taolo tša dibeke tše 8 (Table 1 le Figure 2G). Ka mo go swanago, kgafetšakgafetša le amplitude ya maphoto a go itiragalela a postsynaptic (sPSCs) di be di bapetšwa le tša sehlopha sa taolo, gomme kgafetšakgafetša ya ditiragalo e ile ya oketšega go tloga go dibeke tše 4 go ya go dibeke tše 5 go ya go dibeke tše 7 go ya go dibeke tše 8 ka koketšego ye e swanago (Setshwantšho 2, H le I). Nako ya go butšwa ga synaptic ka PNs (25). Dipoelo tše di swanago di hweditšwe ka morago ga diphatšhe tša PNs tše di phunyeleditšwego. Peakanyo ye e thibela tefo ye e kgonegago ya diphošo tša ATP ya sele, bjalo ka ge go ka direga go rekotong ya clamp ya patch ya sele ka moka. Ka mo go kgethegilego, bokgoni bja lera la go khutša le maqhubu a go thuntšha ka go itiragalela ga di-neuron tša Mfn2cKO ga se tša amega ( Seswantšho 2 , J le K ). Ka boripana, dipoelo tše di laetša gore di-PN tšeo di nago le go se šome gabotse ga OXPHOS mo go lego molaleng di ka lebeletšana le dipaterone tša go tšhollwa ga maqhubu a magolo gabotse, e lego seo se bontšhago gore go na le mokgwa wa diputseletšo wo o di dumelelago go boloka dikarabelo tša electrophysiological tšeo di nyakilego go ba tše di tlwaelegilego.
Data di bontšhwa bjalo ka magareng ± SEM (tshekatsheko ya tsela e tee ya phapano, teko ya go bapetša ya Holm-Sidak ye ntši; * P <0.05). Nomoro ya yuniti e bontšhwa ka maswaodikga.
Re ile ra itlhoma go nyakišiša ge e ba legoro le ge e le lefe ka gare ga dataset ya proteomics (Figure 1G) le akaretša ditsela tšeo di ka lwantšhago tlhaelelo ye šoro ya OXPHOS, ka go realo ra hlaloša gore ke ka lebaka la eng PN ye e amegilego e ka boloka electrophysiology ye e nyakilego go ba ye e tlwaelegilego (Figure 2, E go ya go K). . Tshekatsheko ya Proteomics e bontšhitše gore diensaeme tšeo di amegago ka go catabolism ya diaminoesiti tša ketane ya makala (BCAA) di be di laolwa godimo kudu (Setshwantšho 3A le Seswantšho S5A), gomme setšweletšwa sa mafelelo acetyl-CoA (CoA) goba succinyl CoA se ka tlaleletša di-tricarboxylate ka modikologong wa arteriosclerosis Acid (TCA). Re hweditše gore diteng tša BCAA transaminase 1 (BCAT1) le BCAT2 ka bobedi di oketšegile. Ba ile ba catalyzed mohato oa pele oa BCAA catabolism ka ho hlahisa glutamate ho tloha α-ketoglutarate ( 26 ). Subunits tsohle tse bopang makala keto keto acid dehydrogenase (BCKD) rarahaneng ba upregulated (rarahaneng catalyzes morago ga moo le irreversible decarboxylation ya sephetho le BCAA khabone marapo) (Figure 3A le Figure S5A). Le ge go le bjalo, ga go diphetogo tše di lego molaleng ka go BCAA ka boyona tšeo di hweditšwego ka go PN ye e hlophišitšwego, yeo e ka bago ka lebaka la go oketšega ga go tšewa ga disele tša diaminoesiti tše tša bohlokwa goba tšhomišo ya methopo ye mengwe (glucose goba esiti ya lactic) go tlaleletša modikologo wa TCA (Setshwantšho S5B). Di-PN tšeo di hlokago OXPHOS di bontšhitše gape go oketšega ga go bola ga glutamine le mediro ya transamination ka dibeke tše 8 tša mengwaga, yeo e ka bontšhwago ke go hlatlošwa ga taolo ya diensaeme tša mitochondrial glutaminase (GLS) le glutamine pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Setshwantšho 3, A le C). Ke habohlokoa ho hlokomela hore ho fihlela-taolo ya GLS e lekanyelitsoe ho spliced ​​isoform glutaminase C (GLS-GAC) (phetoho ea Mfn2cKO / CTRL ke hoo e ka bang 4.5-mene, P = 0.05), le lona itseng ho fihlela-taolo ka dinama tse nyenyane tse kankere Ka tšehetsa mitochondrial bioenergy. (27) (27).
(A) Mmapa wa phišo o bontšha phetogo ya go mena ya maemo a proteine ​​bakeng sa tsela ye e laeditšwego ka dibeke tše 8. (B) Mohlala wa selae sa cerebellar seo se swailwego ka anti-PCx antibody (sekala baara, 20 μm). Motsu o mosehla o šupa mmele wa sele ya Purkinje. (C) Nako thuto protheine polelo and analysis hlwaya e le nkgetheng bohlokoa bakeng sa atherosclerosis (multiple t-teko, * FDR <5%; n = 3-5 litoeba). (D) Ka godimo: Seswantšho sa sekema seo se bontšhago ditsela tše di fapanego tša go tsena ka gare ga khapone ye e swailwego yeo e lego ka gare ga [1-13C]pyruvate tracer (ke gore, ka PDH goba tsela ya go putla ditšhika). Ka fase: Tšhate ya violin e bontšha phesente ya khapone ye e swailwego e tee (M1) yeo e fetotšwego go esiti ya aspartic, esiti ya citric le esiti ya malic ka morago ga go swaya dilae tša cerebellar tše di hlobaetšago ka [1-13C]pyruvate (para t-test; ** P <0.01). (E) Tshekatsheko ye e feletšego ya histori ya nako ya tsela ye e bontšhitšwego. Ela hloko feela diprotheine tšeo di nago le P<0.05 ka dibeke tše 8 . Mola wa go kgaoga: ga go na boleng bja peakanyo (tshekatsheko ya ditsela tše pedi ya phapano; * P <0.05; *** P <0.001). Data di bontšhwa bjalo ka magareng±SEM.
Tshekatshekong ya rena, catabolism ya BCAA e fetogile ye nngwe ya ditsela tše bohlokwa tša go oketša taolo. Taba ye e šišinya ka maatla gore bophagamo bja go tsenya moya bjo bo tsenago modikologong wa TCA bo ka fetošwa ka go PN yeo e hlokago OXPHOS. Se se ka emela mokgwa o mogolo wa go tsenya megala ya metaboliki ya di-neuron, yeo e ka bago le khuetšo e lebanyago go fisiolotši ya di-neuron le go phologa nakong ya tlhokomelo ya go se šome gabotse mo gogolo ga OXPHOS. Tumellano le kgopolo-taba ena, re fumane hore ka sehloohong-ba khahlanong le atherosclerotic ensaeme PCx e ho fihlela-laoloa (Mfn2cKO / CTRL fetola hoo e ka bang 1.5 makhetlo; Figure 3A), e leng catalyzes phetolelo ea pyruvate ho oxaloacetate (28), e leng go dumelwa hore e ka dinama tse nyenyane tse boko The polelo ka e lekanyelitsoeng ho astrocytes (29, 30). Go sepelelana le dipoelo tša proteomics, microscopy ya confocal e bontšhitše gore polelo ya PCx e be e oketšegile ka go lebanya le kudu go di-PN tšeo di hlaelelago OXPHOS, mola go arabela ga PCx go be go lekanyeditšwe kudu go disele tša Bergmann glial tše di bapilego tša taolo ( Seswantšho 3B ). Go leka ka mo go šomago upregulation ye e hlokometšwego ya PCx, re ile ra alafa dilae tša cerebellar tše di hlobaetšago ka [1-13C] pyruvate tracer. Ge pyruvate e be e oxidized ke pyruvate dehydrogenase (PDH), leina la yona la isotope le ile la nyamelela , Eupša e tsenywa ka gare ga dilo tša magareng tša modikologo wa TCA ge pyruvate e metabolized ka dikarabelo tša methapo (Setshwantšho 3D). Go thekga ya data ya rena ya proteomics, re lemogile palo ye kgolo ya maswao go tšwa go tracer ye ka gare ga esiti ya aspartic ya dilae tša Mfn2cKO, mola esiti ya citric le esiti ya malic le tšona di be di na le tshekamelo ye e lekanetšego, le ge e se ya bohlokwa ( Seswantšho 3D ).
Ka di-neuron tša dopamine tša dipeba tša MitoPark tšeo di nago le go se šome gabotse ga mitochondrial mo go bakilwego ke di-neuron tša dopamine tšeo di senyago ka go lebanya lephelo la mitochondrial transcription factor A (Tfam) (Setshwantšho S6B), polelo ya PCx le yona e be e laolwa godimo kudu (31), e bontšha gore acetone acid arteriosclerosis Tiragalo ya bolwetši e laolwa nakong ya go se šome gabotse ga neuronal OXPHOS ka mmeleng. Ke mo go swanetšego go lemoga gore go hweditšwe gore diensaeme tša moswananoši (32-34) tšeo di ka bontšhwago ka di-neuron tšeo di ka bago di tswalanywa le arteriosclerosis di laolwa godimo kudu go di-PN tšeo di hlokago OXPHOS, go swana le propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA e fetolela propionyl-CoA go succinyl-CoA le ensaeme ya mitochondrial malic 3 (ME3), . bao tema ya bona e kgolo e lego go bušetša pyruvate go tšwa go malate (Setshwantšho 3, A le C) (33, 35). Go tlaleletša, re hweditše koketšego ye kgolo ya ensaeme ya Pdk3, yeo e phosphorylates gomme ka go realo e inactivate PDH ( 36 ), mola go se na diphetogo tšeo di lemogilwego ka go ensaeme ya Pdp1 yeo e dirago gore PDH goba PDH enzyme complex ka boyona e šome ( Seswantšho 3A ). Ka go se fetoge, ka Mern2cKO PNs, phosphorylation ya α1 subunit α (PDHE1α) subunit ya pyruvate dehydrogenase E1 karolo ya PDH rarahaneng ka Ser293 (tsejoang ho thibela mosebetsi ensaeme ya PDH) ile ntlafatsoa ( Figure S6C) (Figure S6C). Pyruvate ga e na phihlelelo ya methapo.
Qetellong, re ile ra fumana hore tsela super ya serine le glycine biosynthesis, amanang mitochondrial folate (1C) potoloho le proline biosynthesis (Figure 1G le Figure S5C) tsohle ba haholo ho fihlela-laoloa, ho ea ka litlaleho, nakong kenya tshebetsong tshebetso. The dinama tse nyenyane tse potolohileng ba kenya tshebetsong le mitochondrial ho se sebetse hantle (5-7). Tshekatsheko ya confocal yeo e thekgago ya data ye ya proteomics e bontšhitše gore ka go PN ka OXPHOS yeo e sego gona, dilae tša cerebellar tša dipeba tša dibeke tše 8 di ile tša bewa ka fase ga serine hydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), ensaeme ya bohlokwa ya modikologo wa folate ya mitochondrial. Karabelo ya bohlokwa ya boitshireletšo bja mmele (Figure S5D). Ka dilae tše 13 tša CU-glucose-incubated acute cerebellar, diteko tša go latišiša metaboliki di tiišeditše gape go ya godimo ga taolo ya serine le proline biosynthesis, e laetša gore go elela ga di-isoform tša khapone ka gare ga serine le proline go oketšegile ( Seswantšho S5E ). Ka ge dikarabelo tšeo di kgothaletšwago ke GLS le GPT2 di ikarabela ka go tswakwa ga glutamate go tšwa go glutamine le transamination magareng ga glutamate le α-ketoglutarate, upregulation ya tšona e bontšha gore di-neuron tšeo di hlaelelago OXPHOS di na le nyakego e oketšegilego ya glutamate , Se se ka ba se lebišitšwe go boloka biosynthesis e oketšegilego ya proline (Figure S5C). Go fapana le diphetogo tše, tshekatsheko ya proteomic ya di-astrocyte tša cerebellar go tšwa go dipeba tša Mfn2cKO tše di itšego tša PN e bontšhitše gore ditsela tše (go akaretša le di-antiperoxidase ka moka) ga se tša fetoga kudu ka polelo, ka go realo e bontšha Redirection ye ya metaboliki e kgetha go PN ye e senyegilego (Fig. S6, D go ya go G).
Ka boripana, ditshekatsheko tše di utollotše dipaterone tše di fapanego kudu tša go tsenywa tirišong ga nako ga ditsela tše itšego tša metaboliki ka go di-PN. Le ge e le gore mošomo wo o sa tlwaelegago wa mitochondrial wa neuronal o ka lebiša go atherosclerosis ya mathomo le go bopega gape ga 1C (Setshwantšho 3E le Seswantšho S5C), gaešita le diphetogo tše di ka bolelelwago pele polelong ya dikopano tša I le IV, diphetogo tša tswako ya serine de novo ke fela E ile ya bonagala fela ka dikgatong tša morago. OXPHOS go se šome gabotse (Setshwantšho 3E le Seswantšho S5C). Diphetho tše di hlaloša tshepedišo ya tatelano yeo go yona mitochondrial (1C cycle) le cytoplasmic (serine biosynthesis) yeo e hlotšwego ke kgateletšego e arabelago ka tirišano le koketšego ya atherosclerosis modikologong wa TCA go bopa leswa metabolism ya neuronal.
Di-PN tša dibeke tše 8 tšeo di hlaelelago OXPHOS di ka boloka mošomo wa go hlohleletša wa maqhubu a magolo gomme tša feta kgokaganong gape ye bohlokwa ya metaboliki go lefela go se šome gabotse ga mitochondrial. Kutollo ye e rotoša kgonagalo ye e kgahlišago ya gore le mo nakong ye, disele tše le tšona di ka Amogela tsenogare ya kalafo go diegiša goba go thibela go senyega ga ditšhika. Morago. Re rarollotše kgonagalo ye ka ditsenogare tše pedi tše di ikemetšego. Mokgweng wa mathomo, re hlamile vector yeo e ithekgilego ka Adeno-associated virus (AAV) gore MFN2 e kgone go bontšhwa ka go kgetha ka go di-PN tšeo di hlaelelago OXPHOS ka vivo ( Seswantšho S7A ). The AAV encoding MFN2 le fluorescent motlalehi liphatsa tsa lefutso mCherry (Mfn2-AAV) ba ile ba netefatsoa ka mantlha neuron litšo ka vitro, e leng etsa hore MFN2 ho bontšitsoe ka mokgwa o itšetlehileng ka Cre le pholosa mitochondrial sebopeho, ka tsela eo thibela neuromutation ka Mfn2cKO neurons ( Figure S7, B, D le E). Se se latelago, re ile ra dira diteko tša ka vivo go stereotactically go tliša Mfn2-AAV ya dibeke tše 8 go cortex ya cerebellar ya Mfn2cKO le dipeba tša taolo, gomme ra sekaseka dipeba tša dibeke tše 12 ( Seswantšho 4A ). Ditoeba tša Mfn2cKO tšeo di alafilwego di hwile ( Seswantšho 1 , A le B ) ( 16 ). Viral transduction ka vivo fella ka polelo e kgethilego ya PN ka didikadikwe ba bang ba cerebellar (Figure S7, G le H). Ente ya AAV ya taolo yeo e bontšhago fela mCherry (Ctrl-AAV) e be e se na mafelelo a magolo go tekanyo ya go senyega ga ditšhika ka diphoofolong tša Mfn2cKO. Ka go fapana, tshekatsheko ya Mfn2cKOs transduced ka Mfn2-AAV e bontšhitše phello ye bohlokwa ya tšhireletšo ya legato la sele ya PN ( Seswantšho 4 , B le C ). Ka mo go kgethegilego, segokanyipalo sa neuron se bonala se nyakile se sa hlaolege le diphoofolo tša taolo ( Seswantšho 4, B le C, le Seswantšho S7, H le I). Polelo ya MFN1 eupša e sego MFN2 e šoma gabotse ka go lekana go phološa lehu la di-neuron ( Seswantšho 4C le Seswantšho S7, C le F), seo se bontšhago gore polelo ya MFN1 ya ka ntle ga popelo e ka tlaleletša ka mo go atlegilego go hloka MFN2. Tshekatsheko ye nngwe maemong a PN a tee e bontšhitše gore Mfn2-AAV e phološitše kudu ultrastructure ya mitochondria, ya tlwaetša maemo a mtDNA, gomme ya bušetša morago polelo ye e phagamego ya leswao la anti-angiogenesis PCx (Setshwantšho 4, C go ya go E ). Tlhahlobo ya pono ya dipeba tša Mfn2cKO tše di phološitšwego ka seemo sa go khutša e bontšhitše gore go ema ga tšona le dika tša go šišinya mmele (go sepela ga S1 go ya go S3) di kaonafaditšwe. Ge re phetha, diteko tše di bontšha gore go tsenywa gape mo go diegilego ga MFN2 ka gare ga di-PN tšeo di hlaelelago kudu OXPHOS go lekane go bušetša morago tšhomišo ya mtDNA le go hlohleletša atherosclerosis, ka go realo go thibela go senyega ga axon le lehu la di-neuron ka vivo.
(A) Sekema se bontšhago lenaneo la teko la go hlaba AAV yeo e ngwalago khoutu ya MFN2 ge tsela ya metaboliki ye e bontšhitšwego e šomišwa. (B) Dinepe tša confocal tša moemedi tša dikarolo tša cerebellar tša dibeke tše 12 tšeo di fetotšwego ka dipeba tša Mfn2cKO ka dibeke tše 8 gomme tša swaiwa ka anti-Calbindin antibody. Ka go le letona: Scaling ya ditlhale tša axon. Sekala sa axon zoom ke 450 le 75 μm. (C) Left: Quantification ya segokanyipalo sa disele tša Purkinje ka gare ga AAV transduction loop (AAV +) (tshekatsheko ya tsela e tee ya phapano; n = 3 dipeba). Tokelo ya: mtDNA tsepamisa maikutlo and analysis ka transduced PN ka beke 12 (unpaired t-teko; n = 6 lisele tse ho tloha litoeba tse tharo). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Moemedi phetiso elektrone micrographs ya PNs ya Mfn2cKO cerebellar dikarolo transduced le bontšitsoeng baerase vectors. Sešira-sefahlego se se pinki se bontšha lefelo leo le tšerwego ke di- dendrite, gomme sekwere sa marontho a masehla se bontšha go godiša mo go filwego ka go le letona; n e emela nucleus. Sekala bareng, 1μm. (E) e bontšha mohlala wa PCx staining ka PN transduced ka dibeke tše 12. Sekala bareng, 20μm. OE, go bolela ka mo go feteletšego; FC, phetoho ya mene.
Mafelelong, re nyakišišitše bohlokwa bja go phologa ga disele tšeo di hlotšwego ke peroxidase go di-PN tšeo di bilego le phihlelo ya go se šome gabotse ga OXPHOS. Re ile ra tšweletša mCherry yeo e ngwalago khoutu ya AAV-shRNA (RNA ya hairpin ye kopana) yeo e lebišitšego ka go lebanya mRNA ya PCx ya toeba (AAV-shPCx), gomme ra hlaba twatši goba taolo ya yona ye e hlakahlakanego (AAV-scr) ka gare ga cerebellum ya dipeba tša Mfn2cKO. Ente e dirilwe ka bekeng ya bone ya mengwaga (Setshwantšho 5A) go fihlelela go knockdown ya PCx ye e šomago gabotse nakong ya ge polelo ya PCx e oketšegile (Setshwantšho 3C) gomme legato la sele ya PN le be le sa dutše le sa senyege (Setshwantšho 1A). Ke mo go swanetšego go lemoga gore go wiša PCx (Setshwantšho S8A) go lebiša go akgofišeng mo gogolo ga lehu la PN, leo e lego lona feela lesale le le thibetšwego la tshwaetšo (Setshwantšho 5, B le C). Gore re kwešiše mokgwa wa ditlamorago tša metaboliki tšeo di hlohleleditšwego ke PCx godimo-taolo, re ile ra ithuta boemo bja redox bja PNs ka morago ga PCx knockdown le AAV-mediated optical biosensor Grx1-roGFP2 di ile tša bontšhwa ka nako e tee (Figure S8, B go ya go D) go hlahloba glutathione Phetogo ye e lekanyeditšwego ya bokgoni bja peptide redox (38). Ka morago ga moo, re ile ra dira microscopy ya go tšea diswantšho ya bophelo ka moka ya fluorescence ya difothone tše pedi (FLIM) ka dilae tša bjoko bjo bo hlobaetšago bja dibeke tše 7 tša Mfn2cKO goba di-littermates tša taolo go utolla diphetogo tšeo di ka bago gona maemong a redox ya cytoplasmic ka morago ga go netefatša maemo a FLIM ( Seswantšho S8 , E go ya go G ). The and analysis bontšitse keketseho e khōlō ka oxidation boemo ba e le 'ngoe Mfn2cKO PNs hloka PCx polelo, e leng fapaneng le taolo neurons kapa Mfn2cKO PNs bontša feela scrambled shRNA (Figure 5, D le E). Ge polelo ya PCx e be e laolwa fase, phesente ya di-PN tša Mfn2cKO tšeo di bontšhago mmušo wa oxidized kudu e ile ya oketšega ka makga a fetago a mararo (Figure 5E), e bontšha gore PCx up-regulation e ile ya boloka bokgoni bja redox bja di-neuron tše di senyegilego.
(A) Sekema se bontšhago lenaneo la teko la go hlaba AAV yeo e ngwalago khoutu ya shPCx ge tsela ya metaboliki ye e bontšhitšwego e šomišwa. (B) Dinepe tša confocal tša moemedi tša dikarolo tša cerebellar tša dibeke tše 8 ka dipeba tša Mfn2cKO tšeo di fetotšwego le go swaiwa ka antibody ya go lwantšha calcineurin ka dibeke tše 4. Sekala bareng, 450μm. (C) Quantification ya Purkinje sele segokanyipalo ka AAV-transduced loops (tsela e le 'ngoe and analysis ya phapang; n = 3 ho 4 litoeba). Data di bontšhwa bjalo ka magareng±SEM; *** P < 0.001 ya go tšhungwa. (D) Moemedi FLIM setšoantšo bontša karolelano bophelo ba 7-beke-old PN bontša glutathione redox kutlo Grx1-roGFP2 tlas'a maemo a boletsoeng teko. LUT (go lebelela-godimo tafola) karo-karolelano: pholoha nako karohano (ka picoseconds). Sekala bareng, 25μm. (E) The histogram bontša kabo ya Grx1-roGFP2 bophelo bohle boleng ho tloha (D) (n = 158 ho 368 lisele tse ka litoeba tse peli tlas'a boemo mong le e mong). Tšhate ya phae ka godimo ga histogram ye nngwe le ye nngwe: e bontšha palo ya disele tšeo di nago le dikelo tša bophelo tše telele kudu (tše khubedu, tše di oxidized) goba tše kopana (tše pududu, tše di fokoditšwego), tšeo di fetago 1 SD ya boleng bja bophelo bja palogare ka go CTRL-AAV-scr. (F) Mohlala o šišintšwego o bontšha phello ya tšhireletšo ya upregulation ya PCx ya neuronal.
Ka moka ga tšona, ya data yeo re e fago mo e bontšha gore go bontšhwa gape ga MFN2 go ka phološa ka botlalo PN ye e tšwetšego pele ka tlhaelelo ye šoro ya OXPHOS, go fokotšega mo gogolo ga mtDNA, le sebopego se se sa tlwaelegago kudu sa go swana le ista, ka go realo go fa tšwelopele ye e tšwelago pele gaešita le malwetšing a tšwetšego pele. Neurodegeneration e nea bohlatse bjo bo ka bušetšwago morago bja kgato ya pele ga lehu la sele. Tekanyo ye ya go fetofetoga ga metaboliki e gatelelwa gape ke bokgoni bja di-neuron bja go hlohleletša atherosclerosis (e rewiring ya modikologo wa TCA), yeo e thibelago polelo ya PCx go di-PN tšeo di hlokago OXPHOS gomme e godiša lehu la sele, ka go rialo e kgatha tema ya tšhireletšo ( Seswantšho 5F ).
Thutong ye, re file bohlatse bja gore karabelo ya di-PN go go se šome gabotse ga OXPHOS ke go kopana ganyenyane-ganyenyane go atherosclerosis ya modikologo wa TCA ka tsela ya go tsenya tirišong ya phapano yeo e šomišwago ke mananeo a metaboliki. Re ile ra tiišetša tshekatsheko ya proteomic ka mekgwa ye mentši ya tlaleletšo gomme ra utolla gore ge re hlohlwa ke go se šome gabotse mo gogolo ga mitochondrial, di-neuron di na le mokgwa wo o bego o sa tsebje pele wa go elasticity ga metaboliki. Re makatšwa ke gore tshepedišo ka moka ya go tsenya megala ga se gore e swaya boemo bja metaboliki bja mafelelo bjo bo sepedišanago le go senyega ga ditšhika ganyenyane-ganyenyane le ka mo go sa fetogego, eupša ya data ya rena e šišinya gore e ka bopa neuron ya tlhokomelo gaešita le mogatong wa pele ga lehu la sele Mokgwa wa go lefela mošomo. Kutollo ye e bontšha gore di- neuron di na le tekanyo e kgolo ya polasetiki ya metaboliki mmeleng. Taba ye e hlatsela gore go tsenywa gape ga MFN2 ka morago go ka bušetša morago polelo ya maswao a bohlokwa a metaboliki le go thibela go senyega ga PN. Ka mo go fapanego, e thibela go thibana ga ditšhika gomme e akgofiša methapo ya tšhika. transsexual.
E nngwe ya diphetho tše di kgahlišago kudu nyakišišong ya rena ke gore di-PN tšeo di hlokago OXPHOS di ka fetoša metabolism ya modikologo wa TCA ka go laola godimo diensaeme tšeo di hlohleletšago ka go lebanya arteriosclerosis. Metabolic rearrangement ke tšobotsi e tloaelehileng ea lisele tse kankere, tse ling tsa tsona itšetlehile ka glutamine ho tlatsetsa TCA potoloho intermediates ho hlahisa fokotsa equivalents, tse khannang ketane ea ho hema le ho boloka tlhahiso ea lipid le nucleotide biosynthesis precursors (39 , 40). Thuto ya morago bjale e bontšhitše gore ka ditlhalenama tša pheriferale tšeo di itemogelago go se šome gabotse ga OXPHOS, kgokagano gape ya metabolism ya glutamine / glutamate le yona ke tšobotsi ye e tšwelelago ( 5 , 41 ), moo tlhahlo ya go tsena ga glutamine modikologong wa TCA e ithekgilego ka Ka lebaka la go ba thata ga kgobalo ya OXPHOS ( 41 ). ). Le ge go le bjalo, go na le go hloka bohlatse bjo bo kwagalago ka ga go swana le ge e le gofe ga polasetiki ya metaboliki ya di-neuron mmeleng le go swanela ga yona mo go kgonegago ka gare ga seemo sa bolwetši. Thutong ya morago bjale ya ka gare ga vitro, di-neuron tša mathomo tša cortical di bontšhitšwe go kgoboketša matamo a glutamate bakeng sa phetišetšo ya ditšhika, ka go rialo di kgothaletša metabolism ya oxidative le atherosclerosis ka tlase ga maemo a kgateletšego ya metaboliki ( 42 ). Ke habohlokoa ho hlokomela hore tlas'a thibelo pharmacological ya TCA potoloho ensaeme succinate dehydrogenase, pyruvate carboxylation ho lumeloa ho boloka tswakana ya oxaloacetate ka setso cerebellar granule neurons ( 34 ). Le ge go le bjalo, kamano ya fisioloji ya mekgwa ye go dinama tša bjoko (moo go dumelwago gore atherosclerosis e lekanyeditšwe kudu go di-astrocyte) e sa na le bohlokwa bjo bohlokwa bja fisioloji ( 43 ). Tabeng ye, ya data ya rena e bontšha gore di-PN tšeo di sentšwego ke OXPHOS mmeleng di ka fetošetšwa go go senyega ga BCAA le carboxylation ya pyruvate, e lego methopo e mebedi e megolo ya tlaleletšo ya dilo tša magareng tša letamo la TCA. Le ge e le gore seabe seo se akanyetšwago sa BCAA catabolism go metabolism ya maatla a neuronal se šišintšwe, go tlaleletša go tema ya glutamate le GABA bakeng sa neurotransmission ( 44 ), go sa dutše go se na bohlatse bja mekgwa ye ka vivo. Ka fao, go bonolo go fopholetša gore di-PN tšeo di sa šomego gabotse di ka lefela ka go iketla tšhomišo ya dilo tša magareng tša TCA tšeo di sepedišwago ke tshepedišo ya go assimilation ka go oketša atherosclerosis. Ka mo go kgethegilego, upregulation ya PCx e ka nyakega go boloka nyakego ye e oketšegilego ya esiti ya aspartic, yeo e bontšhitšwego ka diseleng tše di atago tšeo di nago le go se šome gabotse ga mitochondrial ( 45 ). Le ge go le bjalo, tshekatsheko ya rena ya metabolomics ga se ya utolla diphetogo tše bohlokwa maemong a go se fetoge a esiti ya aspartic ka go Mfn2cKO PNs (Setshwantšho S6A), yeo go akanyetšwago gore e bontšha tšhomišo ye e fapanego ya metaboliki ya esiti ya aspartic magareng ga disele tšeo di atago le di-neuron tša ka morago ga mitotic . Le ge e le gore mokgwa wo o nepagetšego wa PCx upregulation ka di-neuron tšeo di sa šomego gabotse ka vivo o sa swanetše go hlaolwa, re bontšhitše gore karabelo ye ya pele ga nako e kgatha tema ye bohlokwa go hlokomeleng boemo bja redox bja di-neuron, bjo bo bontšhitšwego ka diteko tša FLIM go dilae tša cerebellar. Ka mo go kgethegilego, go thibela di-PN go up-regulating PCx go ka lebiša boemong bja oxidized kudu le go akgofiša lehu la sele. Go tsenywa tirišong ga go senyega ga BCAA le carboxylation ya pyruvate ga se ditsela tša go hlaola dinama tša pheriferale tša go se šome gabotse ga mitochondrial ( 7 ). Ka gona, go bonagala e le sebopego seo se tlago pele sa di- neuron tšeo di hlaelelago OXPHOS, gaešita le ge e se tšona feela tšobotsi, yeo e lego bohlokwa bakeng sa go senyega ga ditšhika. .
Bolwetši bja cerebellar ke mohuta wa heterogeneous wa bolwetši bja neurodegenerative bjo gantši bo bonagalago bjalo ka ataxia gomme gantši bo senya di-PN ( 46 ). Palo ye ya di-neuron e kotsing kudu ya go se šome gabotse ga mitochondrial ka gobane go senyega ga bona mo go kgethilwego go dipeba go lekane go tšweletša gape dika tše dintši tša ditho tšeo di hlaolago ataxia ya spinocerebellar ya batho ( 16 , 47 , 48 ). Go ya ka dipego, mohlala wa toeba ya transgenic yeo e nago le lephelo la mutant o tswalanywa le ataxia ya spinocerebellar ya motho gomme o na le go se šome gabotse ga mitochondrial ( 49 , 50 ), e gatelela bohlokwa bja go ithuta ditlamorago tša tlhaelelo ya OXPHOS go PNPH. Ka gona, e loketše kudu go arola le go ithuta ka mo go atlegilego palo ye ya moswana-noši ya di- neuron. Le ge go le bjalo, ge go fiwa gore di-PN di na le kwelobohloko kudu go kgatelelo gomme di akaretša karolo ya fase ya palo ka moka ya disele tša cerebellar, go dinyakišišo tše ntši tše di theilwego go omics, karoganyo ya go kgetha ya tšona bjalo ka disele ka moka e sa le lehlakore leo le hlohlago. Le ge go nyakile go sa kgonege go fihlelela go hloka tšhilafalo ka mo go feletšego ga mehuta ye mengwe ya disele (kudu-kudu dinama tša batho ba bagolo), re kopantše kgato ye e šomago ya go arogana le FACS go hwetša palo ye e lekanego ya di-neuron tše di šomago bakeng sa tshekatsheko ya proteomics ya ka tlase ga noka, gomme re na le khupetšo ya proteine ​​ye e phagamego kudu (diprotheine tše ka bago tše 3000) ge di bapetšwa le sete ya data ye e lego gona ya cerebellum ka moka (51). Ka go boloka go kgonagala ga disele ka moka, mokgwa wo re o fago mo ga o re dumelela fela go hlahloba diphetogo ditseleng tša metaboliki ka gare ga mitochondria, eupša gape le go hlahloba diphetogo tša balekane ba yona ba cytoplasmic, yeo e tlaleletšago tšhomišo ya go humiša leina la lera la mitochondrial leo le itšego go mehuta ya disele Mokgwa o mofsa wa palo ya mitochondria ka gare ga dinama tše di raraganego (52, 53). Mokgwa wo re o hlalošago ga o amane fela le thuto ya disele tša Purkinje, eupša o ka dirišwa gabonolo go mohuta ofe goba ofe wa sele go rarolla diphetogo tša metaboliki bjokong bjo bo babjago, go akaretšwa dika tše dingwe tša go se šome gabotse ga mitochondrial.
Mafelelong, re lemogile lefasetere la kalafo nakong ya tshepedišo ye ya peakanyoleswa ya metaboliki yeo e ka bušetšago morago ka mo go feletšego maswao a bohlokwa a kgateletšego ya disele le go thibela go senyega ga di- neuron. Ka gona, go kwešiša ditlamorago tša mošomo tša go tsenya megala yeo e hlalositšwego mo go ka nea ditemogo tša motheo mabapi le dikalafo tšeo di kgonegago bakeng sa go boloka go kgona ga di- neuron nakong ya go se šome gabotse ga mitochondrial. Dinyakišišo tša nakong e tlago tšeo di lebišitšwego go aroleng diphetogo tša metabolism ya matla mehuta e mengwe ya disele tša bjoko di a nyakega bakeng sa go utolla ka mo go feletšego go šoma ga molao wo wa motheo malwetšing a mangwe a methapo.
Ditoeba tša MitoPark di hlalositšwe peleng ( 31 ). C57BL / 6N litoeba le loxP flanking Mfn2 liphatsa tsa lefutso li hlalositsoe pele ( 18 ) le tšela le L7-Cre litoeba ( 23 ). Ditlogolo tša heterozygous tše pedi tšeo di tšweletšwago di ile tša tshela ka morago le dipeba tša Mfn2loxP/Mfn2loxP tša homozygous go tšweletša di-knockout tša dikarolwana tša leabela tše di itšego tša Purkinje bakeng sa Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Ka sehlopha se senyenyane sa go nyalana, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP allele (ema-mtYFP) e ile ya tsebagatšwa ka difapano tša tlaleletšo ( 20 ). Ditshepetšo ka moka tša diphoofolo di dirilwe go ya ka ditlhahlo tša Yuropa, tša bosetšhaba le tša setheo gomme tša dumelelwa ke LandesamtfürNatur ya Umwelt le Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Jeremane. Mošomo wa diphoofolo gape o latela tlhahlo ya European Federation of Laboratory Animal Sciences Associations.
Ka morago ga go thethefatšwa ga go phatloga ga molomo wa popelo wa mosadi wa moimana, embryo ya toeba e a arolwa (E13). Cortex e ile ya arolwa ka gare ga Tharollo ya Letswai ye e Lekalekanego ya Hanks (HBSS) yeo e tlaleleditšwego ka 10 mM Hepes gomme ya fetišetšwa go Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium yeo e nago le papain (20 U/ml) le cysteine ​​(1μg/ml). Duša dinama tse nyenyane tse ka DMEM) le dissociate e ka tshilo ya dijo ya enzymatic. Ml) ka 37°C ka metsotso ye 20, gomme ka morago ya šilwa ka motšhene ka gare ga DMEM yeo e tlaleleditšwego ka 10% ya serum ya kgomo ya fetus. Disele di ile tša bjalwa godimo ga dikhupetšo tša khalase tše di tloditšwego ka polylysine ka segokanyipalo sa 2 × 106 ka sebjana sa setšo sa 6 cm goba ka segokanyipalo sa 0.5 × 105 disele/cm2 bakeng sa tshekatsheko ya go tšea diswantšho. Ka morago ga diiri tše 4, sedirišwa se ile sa tšeelwa legato ke sedirišwa sa go hloka serum sa Neurobasal seo se nago le 1% ya tlaleletšo ya B27 le 0.5 mM GlutaMax. Di-neuron di ile tša hlokomelwa ka morago go 37°C le 5% CO2 go ralala le teko, gomme tša fepša gatee ka beke. Gore go hlohleletšwe kopanyo gape ka vitro, 3μl (sebjana sa setšo sa didiba tše 24) goba 0.5μl (poleiti ya didiba tše 24) ya vector ye e latelago ya twatši ya AAV9 e ile ya šomišwa go alafa dinyurone ka letšatši la bobedi ka vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, nomoro ya lelokelelo la 105530-AAV9) le AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, nomoro ya lelokelelo la 105545-AAV9).
Mouse Mfn1 le Mfn2 tlaleletšo DNA (e hweditšwego go tšwa go Addgene plasmid #23212 le #23213, ka go latelelana) di swailwe ka tatelano ya V5 (GKPIPNPLLGLDST) ka C-terminus, gomme di kopantšwe le mCherry ka foreime ka tatelano ya T2A. Grx1-roGFP2 ke mpho go tšwa go Heidelberg T. P. Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Ka go tšea legato la khasete ya tdTomato ka go šomiša mekgwa ye e tlwaelegilego ya go dira clone, khasete e ile ya subcloned ka gare ga mokokotlo wa pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (Nomoro ya tšhupetšo ya Addgene 28306) go tšweletša pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 le diveketoro tša pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Leano le le swanago le ile la šomišwa go tšweletša vector ya taolo pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Gore go tšweletšwe sebopego sa AAV-shPCx, go nyakega vector ya AAV ya plasmid (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), yeo e nago le tatelano ya DNA yeo e ngwalago khoutu ya shRNA yeo e nepišago PCx ya toeba (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAACCTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) Ka tlase ga taolo ya motšweletši wa U6, mCherry e šomišwa ka fase ga taolo ya motšweletši wa CMV. Tšweletšo ya diphetetši tša AAV tša go thuša e dirilwe go ya ka ditaelo tša motšweletši (Cell Biolabs). Ka boripana, šomiša plasmid ya phetišetšo yeo e rwelego mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ka nakwana Phetišetšo ya disele tše 293AAV-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) goba Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) go ngwala khoutu ya lephelo, gammogo le go ngwala khoutu ya AAV1 capsid proteine ​​le protheine ya tlaleletšo Packaging plasmid plasmid, ka go šomiša mokgwa wa khalsiamo fosfate. Supernatant ya twatši ye tala e hweditšwe ka didikologa tša go gatsela-thaw ka gare ga bate ya leqhwa ye e omilego/ethanol le disele tše di lysed ka gare ga phosphate buffered saline (PBS). Vector ya AAV e ile ya hlwekišwa ka ultracentrifugation ya iodixanol gradient ye e sa tšwelago pele (diiri tše 24 ka 32,000 rpm le 4°C) gomme ya tsepama ka go šomiša sefa ya centrifugal ya Amicon ultra-15. Genome titer ya AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9 × 1013 genome khopi (GC) / ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1 × 1012 GC / ml), AAV1-CAG- FLEX e ne e le joalokaha ho hlalositsoe pele (54), lekanngoa ka nako ea sebele boleng PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC / di ml) le AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC / di ml).
Di-neuron tša mathomo di ile tša gogwa ka gare ga 1x PBS yeo e tonyago leqhoa, tša pelleted, gomme ka morago tša homogenized ka gare ga 0.5% Triton X-100 / 0.5% ya sodium deoxycholate/PBS lysis buffer yeo e nago le phosphatase le protease inhibitor (Roche). Tekanyetšo ya proteine ​​e dirilwe ka go šomiša tshekatsheko ya esiti ya bicinchoninic (Thermo Fisher Scientific). Diprotheine di ile tša arolwa ka morago ka SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, gomme ka morago tša phumolwa godimo ga lera la polyvinylidene fluoride (GE Healthcare). Thibela mafelo ao e sego a itšego gomme o duše ka antibody ya mathomo (bona Lenaneo la S1 go hwetša dintlha) ka gare ga maswi a 5% ka gare ga TBST (Tris-buffered saline with Tween), magato a go hlatswa le antibody ya bobedi ka gare ga TBST Incubate. Duša ka antibody ya mathomo bošego ka moka ka +4°C. Ka morago ga go hlatswa, diriša sebolaya-ditwatši sa bobedi diiri tše 2 ka themperetšheng ya phapoši. Ka morago ga moo, ka go duša blot ye e swanago ka anti-β-actin antibody, go rwala mo go swanago go ile gwa tiišetšwa. Go utolla ka go fetolela go chemiluminescence le go godiša chemiluminescence (GE Healthcare).
Di-neuron tšeo di bjetšwego peleng godimo ga di-coverslip tša galase di ile tša tsepama ka 4% ya paraformaldehyde (PFA)/PBS ka ntlheng ya nako ye e laeditšwego ka themperetšheng ya phapoši ka metsotso ye 10. Di-coverslip di thoma ka go tsenelela ka 0.1% ya Triton X-100/PBS ka metsotso ye 5 ka themperetšheng ya phapoši, gomme ka morago ka gare ga buffer ya go thibela [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS]. Ka letšatši la bobedi, di-coverslip di ile tša hlatswiwa ka buffer ya go thibela gomme tša bjalwa ka antibody ya bobedi ya maleba ya fluorophore-conjugated ka diiri tše 2 ka themperetšheng ya phapoši; mafelelong, disampole di ile tša hlatswiwa ka botlalo ka PBS ka 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) e counterstained gomme ka morago ya tsepama godimo ga selaete sa maekerosekopo ka Aqua-Poly/Mount.
Ditoeba (tše tona le tše tshadi) di ile tša thethefatšwa ka go hlabja ka gare ga mpa ya ketamine (130 mg/kg) le xylazine (10 mg/kg) gomme tša laolwa ka fase ga letlalo ka carprofen analgesic (5 mg/kg) , Gomme tša bewa ka gare ga sedirišwa sa stereotactic (Kopf) seo se hlomilwego ka pad ye borutho. Pepentšha legata gomme o šomiše sedirišwa sa go phunya sa meno go sesa karolo ya cortex ya cerebellar yeo e sepelelanago le lesapo la mis (go tšwa go lambda: mosela 1.8, lateral 1, yeo e sepelelanago le lobules IV le V). Diriša nalete ya sering ye e kobegilego go bopa ka kelohloko lešoba le lennyane ka legata go efoga go šitiša methapo ya ka fase. Ka morago ga moo capillary ya khalase ye e thadilwego ye sesane e tsenywa ka go nanya ka gare ga micro-lesoba (go tloga go -1.3 go ya go -1 ka lehlakoreng la ventral la dura mater), gomme 200 go ya go 300 nl AAV e hlabja ka gare ga micro-injector (Narishige) ka disirinji tša seatla (Narishige) ka makga a mmalwa ka kgatelelo ya fase ka nako ya lefasetere la metsotso ye 10 go ya go ye 20. Ka morago ga go tsenywa, bea capillary metsotso ye mengwe ye 10 go dumelela twatši go phatlalala ka botlalo. Ka morago ga ge di- capillary di gogetšwe morago, letlalo le rokwa ka kelohloko go fokotša go ruruga ga dintho le go dumelela phoofolo go fola. Diphoofolo di ile tša alafša ka dihlare tša go okobatša bohloko (caspofen) ka matšatši a mmalwa ka morago ga go buiwa, ka nako yeo boemo bja tšona bja mmele bo ile bja hlokomelwa ka kelohloko gomme ka morago tša bolawa ka nako yeo e boletšwego. Ditshepetšo ka moka di dirilwe go ya ka ditlhahlo tša Yuropa, tša bosetšhaba le tša setheo gomme di dumeletšwe ke LandesamtfürNatur ya Umwelt le Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Jeremane.
Diphoofolo di ile tša thethefatšwa ka ketamine (100 mg/kg) le xylazine (10 mg/kg), gomme pelo e ile ya tšhelwa ka 0.1 M PBS pele, gomme ka morago ka 4% PFA ka PBS. Dinama di ile tša arolwa gomme tša tsepama ka gare ga 4% PFA/PBS bošego ka moka ka 4°C. Thipa ye e thothomelago (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) e ile ya šomišwa go lokišetša dikarolo tša sagittal (botenya bja 50 μm) go tšwa bjokong bjo bo sa fetogego ka go PBS. Ntle le ge go laeditšwe ka tsela ye nngwe, go tšhilafatša dikarolo tše di phaphametšego ka bolokologi go dirilwe bjalo ka ge go hlalošitšwe ka mo godimo (13) ka themperetšheng ya phapoši le go hlohleletša. Ka boripana, pele, dilae tše di hweditšwego di ile tša permeabilized ka 0.5% Triton X-100/PBS ka metsotso ye 15 ka themperetšha ya phapoši; bakeng sa ba bang ba epitopes (Pcx le Shmt2), ka ka tris-EDTA buffer ka 80 ° C (PH 9) futhumatsang dilae bakeng sa metsotso e 25 ho e-na le mohato ona. Se se latelago, dikarolo di ile tša bjalwa ka antibody ya mathomo (bona Lenaneo la S1) ka gare ga buffer ya go thibela (3% BSA/PBS) ka 4°C bošego ka moka ka go hlohleletša. Letšatšing le le latelago, dikarolo di ile tša hlatswiwa ka buffer ya go thibela gomme tša bjalwa ka antibody ya bobedi ya maleba ya fluorophore-conjugated ka diiri tše 2 ka themperetšheng ya phapoši; mafelelong, dikarolo di ile tša hlatswiwa ka botlalo ka PBS, tša counter-stained ka DAPI, gomme ka morago tša lokišwa ka AquaPolymount Ka selaete sa maekerosekopo.
Maekerosekopo ya confocal ya go hlahloba ka laser (TCS SP8-X goba TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) yeo e nago le laser ya seetša se sešweu le laser ya 405 diode ultraviolet e ile ya šomišwa go tšea seswantšho sa sampole. Ka go thabiša fluorophore le go kgoboketša leswao ka Hybrid Detector (HyDs), LAS-X software e ile ya šomišwa go kgoboketša diswantšho tše di kgobokeditšwego tšeo di dumelelanago le Nyquist sampling ka mokgwa wa tatelano: bakeng sa diphanele tšeo e sego tša boleng, ke matshwao a go fetoga kudu (mohlala, ka diseleng tša somatic le dendrites) mtYFP) Diriša HyD go utolla palo ya di-PN ka mokgwa wa BrightR). Gating ya 0.3 go ya go 6 ns e dirišwa go fokotša mokokotlo.
Go tšea diswantšho ka nako ya kgonthe ga disele tše di hlophišitšwego. Ka morago ga go hlopha ka gare ga Neurobasal-A sedirišwa seo se nago le 1% ya tlaleletšo ya B27 le 0.5 mM GlutaMax, disele di ile tša bjalwa ka pela godimo ga diselaete tša khalase tše di tloditšwego ka poly-l-lysine (μ-Slide8 Well, Ibidi, nomoro ya lelokelelo 80826) , Gomme ka morago e e boloke go 37°C le 5% CO2 ka iri ye 1 go dumelela disele go dula. Nako ya nnete go tšea diswantšho go dirilwe ka maekerosekopo ya confocal ya go hlahloba ya laser ya Leica SP8 yeo e nago le laser ye tšhweu, HyD, 63 × [1.4 aperture ya dipalo (NA)] lense ya sepheo sa oli le sefala sa go ruthetša.
Toeba e ile ya thethefatšwa ka pela ka khaponetaeoksaete gomme ya kgaolwa hlogo, bjoko bo ile bja tlošwa ka pela legata, gomme bja segwa ka botenya bja 200μm (bakeng sa teko ya go swaya ya 13C) goba ya botenya bja 275μm (bakeng sa diteko tše pedi tša photon) karolo ya sagittal yeo e tletšego ka didirišwa tše di latelago The ice cream (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jeremane) e tletše ka dilo tše di latelago: 125 mM e tonyago leqhoa, e kgotsofetšego ka khapone (95% O2 le 5% CO2) ya fase Ca2 + seela sa maitirelo sa cerebrospinal (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25 mM NaHCO3, 25 mM glucose, 0.5 mM CaCl2 le 3.5 mM MgCl2 (kgatelelo ya osmotic ya 310 go ya go 330 mmol). Fetišetša dilae tša bjoko tše di hweditšwego go phapoši ya pele ga go duša yeo e nago le Ca2 + ACSF ya godimo (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 le 2.0 mM MgCl2) Magareng) pH 7.4 le 310 go ya go 320 mmol).
Nakong ya tshepedišo ya go tšea diswantšho, dilae di ile tša hudušetšwa ka phapošing ye e kgethegilego ya go tšea diswantšho, gomme teko e dirilwe ka fase ga go tšhelwa ga ACSF mo go tšwelago pele ka themperetšha ye e sa fetogego ya 32° go ya go 33°C. Maekrosekopo ya go hlahloba ya laser ya diphothone tše dintši (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) yeo e nago le lense ya maikemišetšo ya Leica 25x (NA 0.95, meetse), Ti: Laser ya safire (Chameleon Vision II, Coherent) e ile ya šomišwa go tšea diswantšho tša selae. Mojule wa FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM ya Grx1-roGFP2. Diphetogo ka boemong bja redox bja cytoplasmic bja di-PN di ile tša lekantšhwa ka FLIM ya di-photon tše pedi ka dilae tša bjoko bja sagittal, moo biosensor ya Grx1-roGFP2 e bego e nepišitše di-PN. Ka lera la PN, tšimo ya go hwetša e kgethwa mo e ka bago 50 go ya go 80 μm ka fase ga bokagodimo bja selae go netefatša gore go na le PN ye e šomago (ke gore, go hloka sebopego sa dipheta goba diphetogo tša sebopego sa neuronal go bapa le di-dendrite) le sensara ya roGFP2 ye botse gabedi le AAV yeo e ngwalago khoutu ya shRNA PCx goba tatelano ya yona ya taolo (e nngwe le e nngwe yeo e bontšhago mmogo mCherry). Kgoboketša diswantšho tša mokgobo o tee ka go godiša ga dijithale ga 2x [bolelele bja maphoto bja go tsoša: 890 nm; 512 nm 512 dipiksele]. Go lemogwa: HyD ya ka gare, sehlopha sa sefa sa fluorescein isothiocyanate (FITC)] le go dira palogare ya seswantšho ka gare ga metsotso ye 2 go ya go ye 3 di šomišwa go netefatša gore diphothone tše di lekanego di a kgoboketšwa (diphothone tše 1000 ka palomoka) bakeng sa go lokela ga koba. Go kwagala ga Grx1-roGFP2 probe le netefatšo ya maemo a FLIM di dirilwe ka go hlokomela boleng bja bophelo bja roGFP2 ge go tlaleletša exogenous 10 mM H2O2 go perfusion ACSF (go godiša oxidation, go feletša ka go oketšega ga bophelo), gomme ka morago ga moo go tlaleletša ka 2 mM dithiothreitol (go fokotša tekanyo ya phokotšo, go feleletša ka go fokotšega ka bophelo) (Setšoantšo S8, D ho G). Diriša softwere ya FLIMfit 5.1.1 go sekaseka dipoelo tše di hweditšwego, go lokela koba e tee ya go bola ya go bontšha ya seswantšho ka moka go IRF ye e lekantšwego (mošomo wa karabelo ya sedirišwa), gomme χ2 e ka ba 1. Go bala nako ya bophelo bja PN e tee, mask go dikologa mmele wa methapo e ile ya thalwa ka seatla, gomme nako ya bophelo ya magareng ka mask ye nngwe le ye nngwe e ile ya šomišwa go lekanyetša boleng.
Tshekatsheko ya bokgoni bja mitochondrial. Ka morago ga ge karolo ya go hlobaetša e bjetšwe ka 100 nM TMRM yeo e okeditšwego ka go lebanya go ACSF ye e tšhetšwego ka metsotso ye 30, diphetogo tša bokgoni bja mitochondrial bja di-PN di ile tša lekantšhwa ka maekerosekopo ya diphothone tše pedi. TMRM go tšea diswantšho go dirilwe ka go thabiša probe ka 920 nm le go šomiša HyD ya ka gare (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) go kgoboketša matshwao; ka go šomiša maphoto a go swana a go hlohleletša eupša go šomiša HyD ya ka gare ye e fapanego (FITC :525/50) go seswantšho sa mtYFP. Šomiša polaka ya ImageJ ya Image Calculator go sekaseka bokgoni bja mitochondrial maemong a sele e tee. Ka bokhutšoanyane, polaka-ka tekano: pontšo = min (mtYFP, TMRM) e sebediswa ho hlwaya mitochondrial sebakeng seo bontšang TMRM pontšo ka Purkinje Somali ka e le 'ngoe-mokgobo confocal setšoantšo sa kanale tshwanelanang. Ebe sebakeng sa pixel ka maske sephetho le e quantified, 'me joale normalized ka tshwanelanang moeli e le 'ngoe-mokgobo setšoantšo sa mtYFP kanale ho fumana karolwana mitochondrial bontšang bokgoni mitochondrial.
Seswantšho se ile sa tlošwa ka software ya Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Bakeng sa diswantšho tše di skenilwego tša dithaele, montage ya thaele e tee e dirwa ka go šomiša algorithm ya go roka ya go itiriša yeo e filwego ke softwere ya LAS-X. Ka morago ga go lekanya seswantšho, šomiša ImageJ le Adobe Photoshop go tšwela pele go šoma seswantšho le go beakanya ka go swana go phadima le phapano. Šomiša Adobe Illustrator bakeng sa go lokišetša diswantšho.
tshekatsheko ya go tsepamiša kgopolo ya mtDNA. Palo ya dišo tša mtDNA e ile ya balwa ka bontši dikarolong tša cerebellar tšeo di ngwadilwego ka dithibela-maikwelo kgahlanong le DNA ka maekerosekopo ya confocal. Lefelo le lengwe le le lengwe leo le lebantšwego le ile la hlolwa bakeng sa mmele wa sele le nucleus ya sele e nngwe le e nngwe, gomme lefelo leo le swanetšego le ile la balwa ka go diriša plug-in ya Multi Measure (software ya ImageJ). Ntšha lefelo la nuclear go tšwa lefelong la mmele wa sele go hwetša lefelo la cytoplasmic. Mafelelong, polaka-in ya Analyze Particles (software ya ImageJ) e ile ya šomišwa go lekanyetša ka go iketla dintlha tša DNA tša cytoplasmic tšeo di bontšhago mtDNA seswantšhong sa moedi, gomme dipoelo tše di hweditšwego di ile tša tlwaetšwa go palogare ya PN ya dipeba tša CTRL. Dipoelo di bontšhwa bjalo ka palogare ya di-nucleoside ka sele.
Tshekatsheko ya polelo ya proteine. Diriša polaka ya ImageJ ya Image Calculator go sekaseka polelo ya proteine ​​ka go PN maemong a sele e tee. Ka bokhutšoanyane, ka setšoantšo sa confocal sa lera le le leng la kanale e tshwanelanang, ka tekano: pontšo = min (mtYFP, antibody), sebakeng sa mitochondrial se bontšang immunoreactivity ho antibody e itseng ka Purkina se a hlwaya. Ebe sebakeng sa pixel ka maske sephetho le e quantified, 'me joale normalized ka tshwanelanang moeli e le 'ngoe-mokgobo setšoantšo sa mtYFP kanale ho fumana karolwana mitochondrial ya protheine bontšitsoeng.
Purkinje sele segokanyipalo and analysis. Plug-in ya Cell Counter ya ImageJ e ile ya šomišwa go sekaseka segokanyipalo sa Purkinje ka go arola palo ya disele tša Purkinje tšeo di balwago ka botelele bja lesale la cerebellar leo le tšerwego ke disele tše di balwago.
Go lokišetša mohlala le go kgoboketša. Boko go tšwa sehlopheng sa taolo le dipeba tša Mfn2cKO di ile tša tsepama ka gare ga 2% PFA/2.5% glutaraldehyde ka gare ga 0.1 M phosphate buffer (PB), gomme ka morago ga moo dikarolo tša coronal di ile tša lokišetšwa ka go šomiša ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Botenya bja 50 go ya go 60 μm) Ke moka di lokišetšwe ka gare ga PB buffer ka 1% ya os tetraoxide le 1.5% ya potasiamo ferrocyanide ka themperetšha ya phapoši ka iri ye 1. Dikarolo di ile tša hlatswiwa gararo ka meetse a distilled, gomme ka morago tša šilafatšwa ka 70% ya ethanol yeo e nago le 1% ya uranyl acetate ka metsotso ye 20. Dikarolo di ile tša felelwa ke meetse ka gare ga bjala bjo bo hlaotšwego gomme tša tsenywa ka gare ga Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, nomoro ya lelokelelo la 14040) magareng ga diselaete tša khalase tše di tloditšwego ka silicon, gomme mafelelong ka 60°C Polymerize ka ontong ka diiri tše 48. Sebaka sa cerebellar cortex se ile sa kgethwa gomme dikarolo tša 50 nm ultrathin di ile tša segwa go Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) gomme tša kgethwa godimo ga keriti ya 2 × 1 mm ya koporo yeo e arotšwego yeo e tloditšwego ka filimi ya polystyrene. Dikarolo di ile tša šilafatšwa ka tharollo ya 4% ya uranyl acetate ka gare ga H2O ka metsotso ye 10, tša hlatswiwa ka H2O ka makga a mmalwa, ka morago ka Reynolds lead citrate ka gare ga H2O ka metsotso ye 10, gomme ka morago tša hlatswiwa ka H2O ka makga a mmalwa. Dimaekrokerafo di tšerwe ka maekerosekopo ya elektrone ya phetišetšo Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ka go šomiša TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 dijithale khamera (TVIPS GmbH, Gauting, USA). Jeremane).
Bakeng sa dipeba tšeo di fetetšwego ke AAV, bjoko bo ile bja arolwa gomme bja segwa ka karolong ya sagittal ya botenya bja 1 mm, gomme cerebellum e ile ya hlahlobja ka go šomiša maekerosekopo ya fluorescence go hlaola lesale leo le fetetšwego ke AAV (ke gore, mCherry e bontšhago). Ke feela diteko tšeo go tšona go hlabja ga AAV go feleletšago ka bokgoni bjo bo phagamego kudu bja phetolelo bja legato la sele ya Purkinje (ke gore mo e nyakilego go ba legato ka moka) bonyenyane ka diring tše pedi tše di latelanago tša cerebellar tšeo di dirišwago. Loop ye e fetotšwego ka AAV e ile ya microdissected bakeng sa bošego ka moka ka morago ga go tsepama (4% PFA le 2.5% glutaraldehyde ka gare ga 0.1 M cocoate buffer) gomme ya šongwa gape. Bakeng sa go tsenya EPON, dinama tše di sa fetogego di ile tša hlatswiwa ka 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem), gomme tša bjalwa ka 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) ka gare ga 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem) Diiri tše 4, ke moka di hlatswiwe diiri tše 2. Pheta ka makhetlo a 3 ka 0.1 M cocamide buffer. Ka morago ga moo, lelokelelo la go rotoga la ethanol le ile la šomišwa go duša tharollo ye nngwe le ye nngwe ya ethanol ka 4°C ka metsotso ye 15 go ntšha meetse ka gare ga dinama. Dinama di ile tša fetišetšwa go propylene oxide gomme tša bjalwa bošego ka moka ka gare ga EPON (Sigma-Aldrich) ka 4°C. Bea dinama ka gare ga EPON ye foreše ka themperetšheng ya phapoši ka diiri tše 2, gomme o e tsenye ka 62°C ka diiri tše 72. Diriša ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) le thipa ya taemane (Diatome, Biel, Switzerland) go sega dikarolo tša 70 nm tša ultrathin, gomme o tšhilafatše ka 1.5% ya uranyl acetate metsotso ye 15 ka 37°C, gomme o šilafatše ka tharollo ya lead citrate metsotso ye 4. Dimaekrokerafo tša elektrone di tšerwe ka go šomiša maekerosekopo ya elektrone ya phetišetšo ya JEM-2100 Plus (JEOL) yeo e nago le Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) le softwere ya DigitalMicrograph (Gatan). Bakeng sa tshekatsheko, di-micrograph tša elektrone di ile tša hwetšwa ka 5000 × goba 10,000 × go godiša ga dijithale.
Tshekatsheko ya sebopego sa mitochondria. Bakeng sa ditshekatsheko ka moka, dikhonthore tša mitochondria ka botee di ile tša hlalošwa ka seatla diswantšhong tša dijithale ka go šomiša softwere ya ImageJ. Ditekanyetšo tša sebopego tše di fapanego di a sekaseka. Kitlano ya mitochondrial e bontšhwa bjalo ka phesente yeo e hweditšwego ka go arola palomoka ya lefelo la mitochondrial la sele ye nngwe le ye nngwe ka lefelo la cytoplasm (sebaka sa cytoplasm = lefelo la sele-sebaka sa nucleus ya sele) × 100. Bokgokolo bja mitochondria bo balwa ka formula [4π∙(sebaka/pherimitha 2)]. Sebopego sa ista sa mitochondria se ile sa sekaseka gomme sa arolwa ka magoro a mabedi (“tubular” le “blister”) go ya ka dibopego tša tšona tše kgolo.
Palo ya autophagosome/lysosome le tshekatsheko ya segokanyipalo. Šomiša softwere ya ImageJ go hlaloša ka seatla dikhonthore tša autophagosome/lysosome ye nngwe le ye nngwe seswantšhong sa dijithale. Sebaka sa autophagosome/lysosome se bontšhwa bjalo ka phesente yeo e balwago ka go arola palomoka ya lefelo la sebopego sa autophagosome/lysosome sa sele ye nngwe le ye nngwe ka lefelo la cytoplasm (lefelo la cytoplasm = lefelo la sele-lefelo la nyuklea)×100. Kitlano ya autophagosomes/lysosomes e balwa ka go arola palomoka ka palo ya dibopego tša autophagosome/lysosome ka sele (go ya ka lefelo la cytoplasmic) (lefelo la cytoplasmic = lefelo la sele-lefelo la nyuklea).
Go swaya bakeng sa go arolwa ga dikarolo tše di hlobaetšago le go lokišetša sampole. Bakeng sa diteko tšeo di nyakago go swaya glucose, fetišetša dilae tša bjoko bjo bo hlobaetšago go phapoši ya pele ga go duša, yeo e nago le khapone ye e kgotsofetšego (95% O2 le 5% CO2), Ca2 + ACSF ya godimo (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO 3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl 2 le 2.0 mM MgCl 2, e fetotšwego go pH 7.4 le 310 go ya go 320 mOsm), yeo go yona glucose e lego 13 C 6- Go tšeelwa legato ga glucose (Eurisotop, nomoro ya lelokelelo CLM-1396). Bakeng sa diteko tšeo di nyakago go swaya ka pyruvate, fetišetša dilae tša bjoko bjo bo hlobaetšago go Ca2 + ACSF ya godimo (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 gomme o oketše 2.0mM MgCl2, beakanya go pH 7.4 le 310 go ya go 320mOsm), gomme o tsenye 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, nomoro ya lelokelelo CLM-1082). Duša dikarolo metsotso ye 90 ka 37°C. Mafelelong a teko, dikarolo di ile tša hlatswiwa ka pela ka tharollo ya meetse (pH 7.4) yeo e nago le 75 mM ammonium carbonate, gomme ka morago ya homogenized ka 40:40:20 (v:v:v) acetonitrile (ACN): methanol: meetse. Ka morago ga ge dikarolo di bjatšwe godimo ga leqhwa metsotso ye 30, dišupo di ile tša centrifuged ka 21,000 g ka metsotso ye 10 ka 4°C, gomme supernatant ye e hlakilego e ile ya omišwa ka gare ga sedirišwa sa go tsepamiša sa SpeedVac. Pellet ya metabolite ye e omilego ye e tšweleditšwego e ile ya bolokwa ka -80°C go fihlela tshekatsheko.
Tshekatsheko ya chromatography ya seela-mass spectrometry ya diaminoesiti tše 13 tše di swailwego ka C. Bakeng sa tshekatsheko ya chromatography-mass spectrometry (LC-MS) ya seela, pellet ya metabolite e ile ya emišwa gape ka gare ga 75μl ya meetse a mphato wa LC-MS (Honeywell). Ka morago ga go centrifugation ka 21,000 g ka metsotso ye 5 ka 4°C, 20 μl ya supernatant ye e hlakišitšwego e ile ya šomišwa go tshekatsheko ya go elela ga amino acid, mola setsopolwa ka moka se ile sa šomišwa ka pela bakeng sa tshekatsheko ya anion (bona ka fase). Amino acid and analysis ile etsoa sebelisa pele hlalositsoeng benzoyl chloride derivatization prothokholo ( 55 , 56 ). Mo mogatong wa mathomo, 10μl ya 100 mM ya sodium carbonate (Sigma-Aldrich) e ile ya tlaleletšwa go 20μl ya setsopolwa sa metabolite, gomme ka morago ga moo 10μl ya 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) e ile ya tlaleletšwa go LC grade ACN. Sampole e ile ya vortexed ka boripana gomme ka morago ya centrifuged ka 21,000 g ka metsotso ye 5 ka 20°C. Fetišetša supernatant ye e hlwekišitšwego go vial ya autosampler ya 2 ml ka go tsenywa ga khalase ya khoune (200 μl ya bophagamo). Disampole di ile tša sekaseka ka go šomiša Acquity iClass ultra-high performance LC system (Waters) yeo e kgokagantšwego le Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) ya tharollo ya godimo ya go nepagala ya spectrometer ya boima (Thermo Fisher Scientific). Bakeng sa tshekatsheko, 2μl ya sampole ya derivatized e ile ya hlabja ka gare ga kholomo ya silika ya T3 ya maatla a magolo ya 100 × 1.0 mm (Meetse) yeo e nago le dikarolwana tša 1.8μm. Sekgahla sa go ela ke 100μl/min, gomme tshepedišo ya buffer e na le buffer A (10 mM ammonium formate le 0.15% ya esiti ya formic ka meetseng) le buffer B (ACN). Gradient ke ka tsela ye e latelago: 0%B ka metsotso ye 0; 0% B . 0 go ya go 15% B ka 0 go ya go 0.1 metsotso; 15 go ya go 17% B ka metsotso ye 0.1 go ya go 0.5; B ka 17 go ya go 55% ka 0.5 go ya go 14 metsotso; B ka 55 go ya go 70% ka metsotso ye 14 go ya go 14.5; ka 14.5 go ya go 70 go ya go 100% B ka metsotso ye 18; 100% B ka metsotso e 18 go ya go e 19; 100 go ya go 0% B ka metsotso ye 19 go ya go 19.1; 0% B ka metsotso e 19.1 go ya go e 28 (55, 56). The QE-HF boima spectrometer sebetsa ka mokgwa wa ionization molemo le boima fapaneng ya m / z (boima / tefo karo-karolelano) ya 50 ho 750. The sebediswa qeto ke 60,000, 'me rua taolo (AGC) ion sepheo fumaneha ke 3 × 106, 'me palo e kahodimodimo ion nako ke 100 milliseconds. Mohlodi wa ionization ya electrospray ye e fišago (ESI) o šoma ka gagamalo ya go gaša ya 3.5 kV, themperetšha ya capillary ya 250°C, phallo ya moya ya sheath ya 60 AU (diyuniti tša boithatelo), le phallo ya moya ya thušo ya 20 AU. 250 ° C . Lense ya S e beakantšwe go 60 AU.
Anion chromatography-MS and analysis ya 13C labeled diesiti manyolo. Seela sa metabolite se se šetšego (55μl) se ile sa sekaseka ka go šomiša tshepedišo ya Dionex ion chromatography (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) yeo e kgokagantšwego le QE-HF mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Ka boripana, 5μl ya setsopolwa sa metabolite e ile ya hlabja ka gare ga kholomo ya Dionex IonPac AS11-HC yeo e hlomilwego ka HPLC (2 mm × 250 mm, bogolo bja dikarolwana 4μm, Thermo Fisher Scientific) ka mokgwa wa go kgorometša-ka karolo ya loop ka tekanyo ya go tlatša ya 1. )on. Dionex IonPac AG11-HC kholomo ya mohlapetši (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Thempheretšha ya kholomo e hlokometšwe go 30°C, gomme autosampler e beakantšwe go 6°C. Diriša khatritšhe ya potasiamo hydroxide yeo e filwego ka meetse a deionized go tšweletša gradient ya potasiamo hydroxide ka jenereithara ya eluent. Karoganyo ya dimetabolite ka seelo sa go ela sa 380μl/min, o diriša gradient ye e latelago: metsotso ye 0 go ya go ye 3, 10 mM KOH; Metsotso e 3 go ya go e 12, 10 go ya go 50 mM KOH; Metsotso e 12 go ya go e 19, 50 go ya go 100 mM KOH; 19 go ya go 21 metsotso , 100 mM KOH; 21 go ya go 21.5 metsotso, 100 go ya go 10 mM KOH. Kholomo e ile ya lekalekanywa gape ka fase ga 10 mM KOH ka metsotso ye 8.5.
Di-metabolite tše di hlatswitšwego di kopantšwe le moela wa tlaleletšo wa isopropanol wa 150μl/min ka morago ga kholomo gomme ka morago tša lebiša go spectrometer ya boima bja tharollo ya godimo yeo e šomago ka mokgwa wa ionization ye mpe. MS e hlokomela boima fapaneng ho tloha m / z 50 ho 750 ka qeto ea 60,000. The AGC e behiloe ho 1 × 106, 'me palo e kahodimodimo ion nako e bolokwa ka 100 ms. Mohlodi wa ESI wo o fišitšwego o be o šomišwa ka gagamalo ya go gaša ya 3.5 kV. Dipeakanyo tše dingwe tša mothopo wa ion ke tše di latelago: themperetšha ya capillary 275°C; phallo ya khase ya sheath, 60 AU; phallo ya khase ya thušo, 20 AU ka 300°C, le go beakanya lense ya S go 60 AU.
Tshekatsheko ya data ya dimetabolite tše di swailwego ka 13C. Šomiša softwere ya TraceFinder (phetolelo ya 4.2, Thermo Fisher Scientific) bakeng sa tshekatsheko ya datha ya tekanyo ya isotope. Boitsebišo bja motswako wo mongwe le wo mongwe bo ile bja netefatšwa ke motswako wa tšhupetšo wo o ka botwago gomme wa sekaseka ka go ikemela. Gore go kgonege go dira tshekatsheko ya go humiša isotope, lefelo la chromatogram ya ion ye e ntšhitšwego (XIC) ya isotope ye nngwe le ye nngwe ya 13C (Mn) le ile la ntšhwa go tšwa go [M + H] +, moo n e lego palo ya khapone ya motswako wo o nepišitšwego, yeo e šomišwago go sekaseka diaminoesiti goba [ MH] + e šomišwa go sekaseka di-anion. Go nepagala ga boima bja XIC go ka fase ga dikarolo tše hlano ka milione, gomme go nepagala ga RT ke metsotso ye 0.05. Tshekatsheko ya go humiša e dirwa ka go bala tekanyo ya isotope ye nngwe le ye nngwe ye e lemogilwego go palomoka ya di-isotope ka moka tša motswako wo o swanetšego. Ditekanyo tše di fiwa bjalo ka dikelo tša diphesente tša isotope ye nngwe le ye nngwe, gomme dipoelo di bontšhwa bjalo ka khumo ya diphesente tša molar (MPE), bjalo ka ge go hlalošitšwe peleng (42).
Pellet ya neuron ye e gatseditšwego e ile ya homogenized ka gare ga methanol ya 80% ya go tonya ya leqhoa (v/v), ya vortexed, gomme ya bjalwa ka -20°C ka metsotso ye 30. Vortex sampole gape gomme o hlohleletše ka +4°C metsotso ye 30. Sampole e ile ya centrifuged ka 21,000 g ka metsotso ye 5 ka 4°C, gomme ka morago ga fao supernatant ye e tšweletšego e ile ya kgoboketšwa le go omišwa ka go šomiša SpeedVac concentrator ka 25°C bakeng sa tshekatsheko ye e latelago. Bjalo ka ge go hlalošitšwe ka mo godimo, tshekatsheko ya LC-MS e dirilwe go diaminoesiti tša disele tše di hlophišitšwego. Ka go šomiša TraceFinder (phetolelo ya 4.2, Thermo Fisher Scientific), tshekatsheko ya datha e dirilwe ka go šomiša boima bja monoisotopic bja motswako wo mongwe le wo mongwe. Quantile normalization ya data metabolite ile etsoa sebelisa preprocessCore software sephutheloana (57).
Selae go lokišetša. Towe e ile ya thethefatšwa ka pela ka khaponetaeoksaete gomme ya kgaolwa hlogo, bjoko bo ile bja tlošwa ka pela legata, gomme thipa ye e thothomelago yeo e tletšego ka leqhwa (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Jeremane) e ile ya šomišwa go e sega ka dikarolo tša sagittal tša 300 go ya go 375 μm Cold carbon gasification (95% O2 le 5% CO2) Low Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 le 6.0 mM MgCl2 Beakanya go pH 7.4 le 310 go ya go 330 mOsm). Fetišetša dilae tša bjoko tše di hweditšwego go phapoši yeo e nago le Ca2 + ACSF ya godimo (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM CaCl2 le mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 le 310 go ya go 320 mOsm). Boloka dilae metsotso ye 20 go ya go ye 30 gore di kgone go bušetšwa pele di rekota.
go rekota. Sefala sa maekerosekopo seo se nago le phapoši ya go rekota ye e sa fetogego le lense ya maikemišetšo a go inela meetseng a 20x (Scientifica) e ile ya šomišwa go direkhoto ka moka. Disele tša Purkinje tšeo go akanyetšwago di ile tša hlaolwa ka (i) bogolo bja mmele, (ii) lefelo la anatomical la cerebellum, le (iii) polelo ya lephelo la motlatša-motlatša-motlatša la mtYFP la fluorescent. Pipette ya patch yeo e nago le kganetšo ya ntlha ya megohms ye 5 go ya go 11 e gogwa ka ntle ke capillary ya khalase ya borosilicate (GB150-10, 0.86 mm × 1.5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Jeremane) le pipette ye e rapaletšego Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA). Direkoto ka moka di ile tša dirwa ke ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Jeremane), yeo e bego e laolwa ke softwere ya Signal (phetolelo ya 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Teko e ile ya rekotwa ka seelo sa go tšea mehlala sa 12.5 kHz. Letshwao le sefa ka difiltara tše pedi tša Bessel tša go feta ka nako ye kopana tšeo di nago le maqhubu a go kgaola a 1.3 le 10 kHz ka go latelelana. The capacitance ya lera le pipette e compensated ke potoloho diputseletšo sebelisa amplifier. Diteko ka moka di dirilwe ka fase ga taolo ya khamera ya Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Jeremane), yeo e bego e laolwa ke softwere ya Hokawo (phetolelo ya 2.8, Hamamatsu, Gerden, Jeremane).
Ka mehla peakanyo ya sele ka moka le tshekatsheko. Gateetee pele o rekota, tlatša pipette ka tharollo ya ka gare yeo e nago le dilo tše di latelago: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potasiamo gluconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine triphosphate (GTP) (Na) le 10.0 mM creatinine phosphate di ile tša beakanywa go pH 7.25, gomme kgatelelo ya osmotic e be e le 290 mOsm (sucrose). Gateetee ka morago ga go diriša matla a 0 pA go phatlola lera, bokgoni bja lera la go khutša bo ile bja elwa. Kganetšo ya go tsenya e lekantšwe ka go diriša maphoto a hyperpolarized a -40, -30, -20, le -10 pA. Lekanya bogolo bja karabelo ya gagamalo gomme o šomiše molao wa Ohm go bala go ganetša ga tsenyo. Mošomo wa go itiragalela o ile wa ngwalwa ka gare ga clamp ya gagamalo ka metsotso ye 5, gomme sPSC e ile ya hlaolwa le go lekantšhwa ka Igor Pro (phetolelo 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) ka go šomiša sengwalwa sa go lemoga seka-go itiriša. The IV koba le tsitsitseng-boemo jwale di lekanngoa ka clamping leshala ka bokgoni fapaneng (ho qala ho tloha -110 mV) le eketsa gagamalo ka 5 mV mehato. Tšweletšo ya AP e ile ya lekwa ka go diriša mohlagase wa depolarizing. Clamp sele ka -70 mV mola o diriša pulse ya bjale ya depolarizing. Beakanya bogolo bja kgato ya yuniti ye nngwe le ye nngwe ya go rekota ka thoko (10 go ya go 60 pA). Bala palo e kahodimodimo maqhubu a AP ka ho bala ka seatla spikes pulse tse bakang maqhubu a phahameng ka ho fetisisa AP. Moedi wa AP o sekasekwa ka go šomiša setšweletšwa sa bobedi sa pulse ya depolarization yeo e hlohleletšago pele AP e tee goba tše ntši.
Perforated patch phetolo le and analysis. Phetha perforated patch rekota sebelisa diprothokholo maemo a. Šomiša pipette ye e se nago ATP- le GTP yeo e se nago metswako ye e latelago: 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA le 2 mM MgCl2, gomme o beakanye go pH 7.2 (o šomiša KOH). ATP le GTP di tlogetšwe go tšwa go tharollo ya ka gare ga sele go thibela go tsenelela mo go sa laolegego ga lera la sele. Pipette ya patch e tladitšwe ka tharollo ya ka gare ye e nago le amphotericin (e ka bago 200 go ya go 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) go hwetša rekoto ya patch ye e phunyeleditšwego. Amphotericin e ile ya hlapološwa ka gare ga dimethyl sulfoxide (tekanyetšo ya mafelelo: 0.1 go ya go 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Go tsepama ga DMSO yeo e dirišitšwego go be go se na mafelelo a magolo go di- neuron tšeo di ithutilwego. Nakong ya tshepedišo ya go phunya, go ganetša ga mokero (Ra) go ile gwa hlokomelwa ka mo go tšwelago pele, gomme teko e ile ya thongwa ka morago ga ge amplitude ya Ra le AP e tsepame (metsotso ye 20-40). Mošomo wa go itiragalela o lekantšwe ka gare ga gagamalo le/goba clamp ya bjale ka metsotso ye 2 go ya go ye 5. Tshekatsheko ya datha e dirilwe ka go šomiša Igor Pro (phetolelo ya 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (phetolelo ya 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) le GraphPad Prism (phetolelo ya 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). United States). Gore go kgonege go hlaola di-AP tšeo di itiragalelago, go dirišwa plug-in ya IgorPro ya NeuroMatic v3.0c. Hlaola ka go itiriša di-AP o šomiša moedi wo o filwego, wo o beakanywa ka botee bakeng sa rekoto ye nngwe le ye nngwe. Ka go šomiša sekgoba sa spike, laetša maqhubu a spike ka palomoka ya maqhubu a spike a ka ponyo ya leihlo le maqhubu a spike a karolelano.
PN go ikarola. Ka go tlwaelana le protocol yeo e phatlaladitšwego peleng, di-PN di ile tša hlwekišwa go tšwa go cerebellum ya toeba ka kgato ye e laeditšwego ( 58 ). Ka boripana, cerebellum e ile ya arolwa gomme ya minced ka gare ga sedirišwa sa go aroganya seo se tonyago leqhoa [ntle le HBSS Ca2 + le Mg2 +, ya tlaleletšwa ka 20 mM glucose, penicillin (50 U/ml) le streptomycin (0.05 mg/ ml)], gomme ka morago ya šila sedirišwa ka gare ga papain [HBSS, yeo e tlaleleditšwego ka 1-cysteine·HCl (1 mg / ml), papain (16 U / ml) le deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg / ml)] Alafa metsotso e 30 ka 30°C. Sa mathomo hlatswa dinama ka gare ga sedirišwa sa HBSS seo se nago le mucus ya mae (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) le DNase (0.1 mg/ml) ka themperetšheng ya phapoši go thibela tšhilo ya dijo ya ensaeme, gomme ka morago ka gare ga sedirišwa sa HBSS seo se nago le 20 mM glucose O šila ka bonolo ka gare ga HBSS, penicillin (50 U/ml), streptomycin (0.05 mg/ml) le DNase (0.1 mg/ml) e lokolla disele tše tee. Go emišwa ga sele ye e tšweletšego go ile gwa sefiwa ka sefepi sa disele sa 70μm, ke moka disele di ile tša pelleted ka centrifugation (1110 rpm, metsotso ye 5, 4°C) gomme tša emišwa gape ka gare ga sedirišwa sa go hlopha [HBSS, go tlaleletšwa ka 20 mM glucose, 20% fetal bovine ) Serum, penicillin (50 U/ml) le streptomycin (0,05 mg / di ml)]; hlahloba go kgonagala ga sele ka propidium iodide le go beakanya segokanyipalo sa sele go 1 × 106 go ya go 2 × 106 disele/ml. Pele ga cytometry ya go ela, go emišwa go be go sefiwa ka sefepi sa disele sa 50 μm.
Phallo ya cytometer. Go hlopha disele go dirilwe ka 4°C ka go šomiša motšhene wa FACSAria III (BD Biosciences) le softwere ya FACSDiva (BD Biosciences, phetolelo 8.0.1). Go emišwa ga sele go ile gwa hlophišwa ka go šomiša nozzle ya 100 μm ka fase ga kgatelelo ya 20 psi ka seelo sa ~2800 ditiragalo/motsotswana. Ka ge ditekanyetšo tša setšo tša go tsenya dikgoro (bogolo bja sele, kgethollo ya bimodal, le dimelo tša go phatlalatša) di sa kgone go netefatša go arolwa mo go nepagetšego ga PN go tšwa go mehuta ye mengwe ya disele, leano la go tsenya dikgoro le beilwe go theilwe godimo ga papiso ye e lebanyago ya maatla a YFP le autofluorescence ka go mitoYFP + le taolo ya mitoYFP − Ditoeba. YFP e thabile ka irradiating sampole le 488 nm tham mong bang laser mola, 'me pontšo e lemohuoa sebelisa 530 / 30 nm sehlopha feta filtara. Ka dipeba tša mitoYFP +, maatla a go lekana a lephelo la motlatša-motlatša-mongwadi wa Rosa26-mitoYFP le ona a šomišwa go kgetholla dikarolwana tša mmele wa neuronal le axon. 7-AAD e thabile ka laser ye serolane ya 561 nm gomme e lemogwa ka filtara ya bandpass ya 675/20 nm go kgapeletša ntle disele tše di hwilego. Gore go arolwe di-astrocyte ka nako e tee, go emišwa ga sele go ile gwa šilafatšwa ka ACSA-2-APC, ke moka sampole e ile ya hlaselwa ka mola wa laser wa 640 nm, gomme go ile gwa dirišwa filtara ya bandpass ya 660/20 nm go utolla leswao.
Disele tše di kgobokeditšwego di ile tša pelleted ka centrifugation (1110 rpm, metsotso ye 5, 4°C) gomme tša bolokwa ka -80°C go fihlela di šomišwa. Dipeba tša Mfn2cKO le dipup tša tšona tša matlakala di arotšwe ka letšatši le tee go fokotša go fetofetoga ga tshepedišo. Tlhagišo ya datha ya FACS le tshekatsheko di dirilwe ka go šomiša softwere ya FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Bjalo ka ge go boletšwe ka mo godimo (59), PCR ya nako ya nnete e šomišwa go arola DNA go tšwa go di-neuron tše di hlophišitšwego bakeng sa go lekanyetša boleng bja mtDNA bjo bo latelago. Linearity le threshold sensitivity di ile tša lekwa mathomong ka go sepetša qPCR go dinomoro tše di fapanego tša disele. Ka boripana, kgoboketša 300 PN ka gare ga buffer ya lysis yeo e bopilwego ka 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 le proteinase K (200 ng/ml) gomme o duše ka 55°C metsotso ye 120. Disele di ile tša bjalwa gape ka 95°C metsotso ye 10 go netefatša go se šome ka botlalo ga proteinase K. Ka go šomiša nyakišišo ya TaqMan (Thermo Fisher) ye e itšego go mt-Nd1, mtDNA e ile ya lekantšhwa ka PCR ya seka-boleng ka tshepedišong ya 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific). Saense, nomoro ya lelokelelo Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, nomoro ya lelokelelo AIVI3E8) le 18S (Thermo Fisher Scientific, nomoro ya lelokelelo Hs99999901_s1) dikarolwana tša leabela.
Proteome sampole go lokišetša. Ka go ruthetša tharollo ka 95 ° C ka metsotso ye 10 le sonicating, ka gare ga buffer ya lysis [6 M guanidine chloride, 10 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride, 10 mM chloroacetamide le 100 mM tris- Lyse dipellets tša neuron tše di gatseditšwego ka gare ga HCl]. Ka Bioruptor (Diagenode) ka metsotso e 10 (metsotswana e 30 pulse / metsotswana e 30 nako ya go khutša). Sampole e ile ya hlapološwa ka 1:10 ka gare ga 20 mM tris-HCl (pH 8.0), ya hlakantšhwa le 300 ng ya gauta ya trypsin (Promega), gomme ya bjalwa bošego ka moka ka 37°C go fihlelela tšhilo ya dijo ka botlalo. Ka letšatši la bobedi, sampole e ile ya centrifuged ka 20,000 g ka metsotso ye 20. Supernatant e ile ya hlapološwa ka 0.1% ya esiti ya formic, gomme tharollo e ile ya tlošwa letswai ka StageTips yeo e itiretšego yona. Sampole e ile ya omišwa ka gare ga sedirišwa sa SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) ka 45°C, gomme ka morago peptide e ile ya emišwa ka gare ga 0.1% ya esiti ya formic. Disampole ka moka di ile tša lokišetšwa ka nako e tee ke motho o tee. Gore go kgonege go sekaseka dišupommu tša astrocyte, 4 μg ya dipeptide tše di tlošitšwego letswai di ile tša swaiwa ka tag ya boima bja tandem (TMT10plex, nomoro ya lelokelelo la 90110, Thermo Fisher Scientific) ka tekanyo ya peptide go TMT reagent ya 1:20. Bakeng sa go swaya TMT, 0.8 mg ya TMT reagent e ile ya emišwa gape ka gare ga 70 μl ya ACN ye e se nago meetse, gomme peptide ye e omilego e ile ya bopša gape go ba 9 μl ya 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate), yeo go yona 7 μl ya TMT reagent ka ACN e ilego ya tlaleletšwa. Mahloriso e ne e le 43.75%. Ka morago ga metsotso ye 60 ya go duša, karabelo e ile ya tingwa ka 2 μl ya 5% ya hydroxylamine. Dipeptide tše di swailwego di ile tša kgoboketšwa, tša omišwa, tša emišwa gape ka gare ga 200μl ya 0.1% ya esiti ya formic (FA), tša arolwa ka tše pedi, gomme ka morago tša tlošwa letswai ka go šomiša StageTips yeo e itiretšego yona. Ka go šomiša UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), e nngwe ya dihalofo tše pedi e ile ya arolwa ka dikarolo godimo ga kholomo ya 1mm x 150mm Acquity chromatographic yeo e tletšego ka dikarolwana tša 130Å1.7μm C18 (Waters, catalog No. SKU: 186006935). Thermo Fisher Mohlapi wa Mahlale). Aroganya dipeptide ka seelo sa go ela sa 30μl/min, aroganya go tšwa go 1% go ya go 50% ya buffer B ka metsotso ye 85 ka gradient ya dikgato ya metsotso ye 96, go tšwa go 50% go ya go 95% buffer B ka metsotso ye 3, ke moka metsotso ye 8 bakeng sa 95 % Buffer B; Buffer A ke 5% ACN le 10 mM ammonium bicarbonate (ABC), gomme buffer B ke 80% ACN le 10 mM ABC. Kgoboketša dikarolwana metsotso ye mengwe le ye mengwe ye 3 gomme o di kopanye ka dihlopha tše pedi (1 + 17, 2 + 18, bjalobjalo) gomme o di omise ka gare ga centrifuge ya lefeela.
Tshekatsheko ya LC-MS / MS. Bakeng sa boima spectrometry, dipeptides (nomoro r119.aq) ba ile ba arolwa ka 25 cm, 75 μm bophara ka hare PicoFrit and analysis kholomo (lense e ncha sepheo, karolo nomoro PF7508250) hlomelloa le 1.9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ mahareng (Dr. Maisch, mat), sebelisa EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Mahlale, Jeremane). Kholomo e be e hlokometšwe ka 50°C. Dibuffer A le B ke 0.1% ya esiti ya formic ka meetseng le 0.1% ya esiti ya formic ka gare ga 80% ya ACN, ka go latelelana. Dipeptide di ile tša arolwa ka gradient ya dikgato ya 200 nl/min go tšwa go 6% go ya go 31% buffer B ka metsotso ye 65, le go tšwa go 31% go ya go 50% buffer B ka metsotso ye 5. Dipeptide tše di hlatswitšwego di ile tša sekaseka ka spectrometer ya boima bja Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Peptide selelekela m / z tekanyo e phethwa ka qeto ea 120,000 ka fapaneng ya 350 ho 1500 m / z. Ka go šomiša 27% ya maatla a thulano a tlwaelegilego, selelekela se maatla kudu seo se nago le seemo sa tefo ya 2 go ya go 6 se kgethwa bakeng sa go arogana ga maatla a magolo a C trap dissociation (HCD). Nako ya modikologo e beakantšwe go 1 s. Boleng bja m / z bja karolwana ya peptide bo ile bja lekantšhwa ka gare ga sefero sa ion ka go šomiša sepheo se senyenyane kudu sa AGC sa 5 × 104 le nako ya go hlaba ya palomoka ya 86 ms. Ka morago ga go arogana, selelekela se ile sa bewa lenaneong la go kgaphelwa ka ntle la go fetoga ka 45 s. Dipeptide tše di swailwego ka TMT di ile tša arolwa ka kholomo ya 50 cm, 75 μm ya Acclaim PepMap (Thermo Fisher Scientific, nomoro ya lelokelelo la 164942), gomme dispektra tša go huduga di ile tša sekaseka ka spektrometara ya boima bja Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) yeo e hlomilwego ka didirišwa tša di-ion tša sebopego sa maphoto sa tšhemo ya godimo ya asymmetric (FAIMS). (Thermo Fisher Scientific) sebetsa ka tse peli diputseletšo gagamalo ya −50 le −70 V. MS3 kgethile thehiloeng synchronization selelekela e sebediswa bakeng sa TMT tlaleho ion pontšo tekanyo. Karoganyo ya peptide e dirilwe ka EASY-nLC 1200, ka go šomiša 90% ya linear gradient elution, ka mahloriso a buffer a 6% go ya go 31%; buffer A e be e le 0.1% FA, gomme buffer B e be e le 0.1% FA le 80% ACN. Kholomo ya tshekatsheko e šomišwa ka 50°C. Šomiša FreeStyle (phetolelo 1.6, Thermo Fisher Scientific) go arola faele ya mathomo go ya ka gagamalo ya tefo ya FAIMS.
Tlhaolelo ya proteine ​​le go lekanyetša boleng. Ka go šomiša entšene ya go nyaka ya Andromeda ye e kopantšwego, ya data ya mathomo e ile ya sekaseka ka go šomiša phetolelo ya MaxQuant 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Go tlaleletša go tatelano ya Cre recombinase le YFP yeo e hweditšwego go tšwa go Aequorea victoria, dispektra tša karolwana ya peptide di ile tša tsongwa tatelano ya canonical le tatelano ya isoform ya proteome ya tšhupetšo ya toeba (Proteome ID UP000000589, yeo e taoneloutšwago go tšwa go UniProt ka Motsheganong 2017) . Methionine oxidation le proteine ​​N-terminal acetylation di ile tša bewa bjalo ka diphetogo tše di fetogago; cysteine ​​carbamoyl methylation e ile ya bewa bjalo ka diphetogo tše di sa fetogego. Ditekanyetšo tša tšhilo ya dijo di beakantšwe go “specificity” le “trypsin/P”. Palo ya fasefase ya dipeptide le dipeptide tša legare tšeo di šomišwago go hlaola diproteine ​​ke 1; palo ya fasefase ya dipeptide tša moswananoši ke 0. Ka fase ga maemo a go swana ga mmapa wa dipeptide, seelo sa go hlaola proteine ​​e be e le 0.01. Kgetho ya “Peptide ya Bobedi” e kgontšhitšwe. Šomiša kgetho ya “go swana magareng ga go kitima” go fetišetša ditšhupetšo tše di atlegilego magareng ga difaele tša mathomo tše di fapanego. Diriša LFQ bonyane tekanyo palo 1 bakeng sa leibole-free quantification (LFQ) (60). Boima bja LFQ bo sefiwa bonyane dikelo tše pedi tše di šomago bonyenyane sehlopheng se tee sa genotype ntlheng ye nngwe le ye nngwe ya nako, gomme e ntšhwa go tšwa go kabo ye e tlwaelegilego ka bophara bja. 0.3 gomme o theogele fase 1.8. Diriša sefala sa khomphutha sa Perseus (https://maxquant.net/perseus/) le R (https://r-project.org/) go sekaseka dipoelo tša LFQ. Teko ya t ya ditsela tše pedi tše di lekanetšego go tšwa go sephuthelwana sa softwere sa limma e ile ya šomišwa bakeng sa tshekatsheko ya polelo ya phapano ( 61 ). Tshekatsheko ya datha ya go nyakišiša e dirwa ka go šomiša ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally le pheatmap. Datha ya proteomics ye e theilwego go TMT e ile ya sekaseka ka go šomiša phetolelo ya MaxQuant 1.6.10.43. Batla datha ya proteomics ye tala go tšwa go polokelo ya tshedimošo ya proteomics ya batho ya UniProt, yeo e taoneloutšwago ka Lewedi 2018. Tshekatsheko e akaretša selo sa phošollo ya bohlweki bja isotope seo se filwego ke motšweletši. Diriša limma ka go R bakeng sa tshekatsheko ya polelo ya phapano. Datha ya mathomo, dipoelo tša nyakišišo ya polokelo ya tshedimošo, le tshepedišo ya mošomo ya tshekatsheko ya datha le dipoelo ka moka di bolokilwe ka gare ga selekane sa ProteomeXchange ka polokelo ya molekane wa PRIDE ka sešupo sa sete ya datha PXD019690.
Ditlhaloso tša mošomo di humiša tshekatsheko. Sedirišwa sa Tshekatsheko ya Tsela ya Bohlale (QIAGEN) se šomišitšwe go bona go huma ga dipeelano tša tlhalošo ya mošomo ya sete ya datha ka dibeke tše 8 (Setshwantšho 1). Ka boripana, lenaneo la diproteine ​​tša boleng leo le hweditšwego go tšwa go tshekatsheko ya datha ya LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) le šomišwa ka ditekanyetšo tša sefa tše di latelago: Mus musculus e kgethwa bjalo ka mehuta ya diphedi le setlogo, gomme legoro le bontšha boleng bja P bjo bo beakantšwego ke Benjamini bakeng sa go humiša 0.05 goba ka fase bo tšewa e le bjo bohlokwa. Bakeng sa kerafo ye, magoro a mahlano a godimo a go feta ka gare ga sehlopha se sengwe le se sengwe ao a theilwego godimo ga boleng bja P bjo bo fetotšwego a bontšhwa. Ka go šomiša teko ya t ye ntši, ka go šomiša lenaneo la go godiša mothalo la magato a mabedi la Benjamini, Krieger, le Yekutieli (Q = 5%), tshekatsheko ya polelo ya proteine ​​ya nako-thuto e dirwa go bonkgetheng ba bohlokwa bao ba hlaotšwego ka legoro le lengwe le le lengwe, gomme mothaladi wo mongwe le wo mongwe o sekasekwa ka thoko. Ga go nyakege gore o amogelwe SD ye e sa fetogego.
Gore re kgone go bapetša dipoelo tša nyakišišo ye le dipolokelo tša tshedimošo tše di phatlaladitšwego le go tšweletša seswantšho sa Venn go Seswantšho 1, re kopantše lenaneo la diprotheine tša boleng le ditlhalošo tša MitoCarta 2.0 ( 24 ). Šomiša sedirišwa sa inthanete sa Thala Seswantšho sa Venn (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) go tšweletša seswantšho.
Bakeng sa tshedimošo ye e tletšego ka ga ditshepedišo tša dipalopalo tšeo di šomišwago go tshekatsheko ya proteomics, hle lebelela karolo ye e swanetšego ya Didirišwa le Mekgwa. Bakeng sa diteko tše dingwe ka moka, tshedimošo ye e tletšego e ka hwetšwa nonwaneng ye e swanetšego. Ntle le ge go laeditšwe ka tsela ye nngwe, datha ka moka e bontšhwa bjalo ka magareng ± SEM, gomme ditshekatsheko ka moka tša dipalopalo di dirilwe ka go šomiša softwere ya GraphPad Prism 8.1.2.
Bakeng sa didirišwa tša tlaleletšo tša sehlogo se, hle bona http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Ye ke sengwalwa sa phihlelelo ye e bulegilego seo se phatlalatšwago ka fase ga dipeelano tša Laesense ya Creative Commons Attribution-Non-Commercial, yeo e dumelelago tšhomišo, kabo le go tšweletša gape ka gare ga sedirišwa sefe goba sefe, ge fela tšhomišo ya mafelelo e se ya poelo ya kgwebo gomme motheo e le gore mošomo wa mathomo o nepagetše. Tšhupetšo.
Ela hloko: Re go kgopela fela gore o nee aterese ya gago ya imeile gore motho yo o mo kgothaletšago letlakaleng a tsebe gore o nyaka gore a bone imeile yeo le gore ga se spam. Re ka se thope diaterese tša imeile dife goba dife.
Potšišo ye e šomišwa go leka ge eba o moeti le go thibela go romela ga spam ka go itiriša.
Ka e. Larson o ile a re
Tshekatsheko ya proteomics ya di- neuron tšeo di sa šomego gabotse e utollotše gore mananeo a metaboliki a šomišwa bakeng sa go lwantšha go senyega ga ditšhika.
Ka e. Larson o ile a re
Tshekatsheko ya proteomics ya di- neuron tšeo di sa šomego gabotse e utollotše gore mananeo a metaboliki a šomišwa bakeng sa go lwantšha go senyega ga ditšhika.
©2020 Mokgatlo wa Amerika wa Tšwetšopele ya Saense. ditokelo tsohle di sireleditswe. AAAS ke molekane wa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef le COUNTER. Kgatelopele ya Mahlale ISSN 2375-2548.