Re leboga go etela Nature.com. Phetolelo ya sephephediši yeo o e šomišago e na le thekgo ye e lekanyeditšwego ya CSS. Bakeng sa dipoelo tše kaone, re kgothaletša gore o šomiše phetolelo ye mpsha ya sephephediši sa gago (goba o šitiše Mokgwa wa go Sepelelana ka go Internet Explorer). Mo nakong ye, go netefatša thekgo ye e tšwelago pele, re bontšha sebaka ntle le setaele goba JavaScript.
Esiti ya propionic (PPA) e šomišwa go ithuta tema ya go se šome gabotse ga mitochondrial ka malwetšing a tlhabollo ya methapo ya go swana le bolwetši bja sepektheramo sa autism. PPA e tsebja ka go šitiša biogenesis ya mitochondrial, metabolism le phetogo. Le ge go le bjalo, ditlamorago tša PPA go mafolofolo a mitochondrial, fission le fusion di dula di na le bothata ka lebaka la tlhago ya nako ye e raraganego ya mekgwa ye. Mo, re šomiša dithekniki tša go tšea diswantšho tša boleng bja tlaleletšo go nyakišiša ka moo PPA e amago ultrastructure ya mitochondrial, sebopego, le mafolofolo ka diseleng tša SH-SY5Y tše di swanago le neuron. PPA (5 mM) e hlotše go fokotšega mo gogolo ga lefelo la mitochondrial (p <0.01), bophara bja Feret le sedikologo (p <0.05), le lefelo la 2 (p <0.01). Mitochondrial ketsahalo locator and analysis bontšitse keketseho e khōlō (p <0.05) ka fission le fusion liketsahalo, ka tsela eo boloka botšepehi ba mitochondrial marangrang tlas'a maemo a khatello ea kelello. Go tlaleletša, polelo ya mRNA ya cMYC (p <0.0001), NRF1 (p <0.01), TFAM (p <0.05), STOML2 (p <0.0001) le OPA1 (p <0.05) e ile ya fokotšwa kudu. 01). Se se bontšha go bopša leswa ga sebopego sa mitochondrial, biogenesis le mafolofolo go hlokomela mošomo ka fase ga maemo a kgateletšego. ya data ya rena e fa temogo ye mpsha ka ga ditlamorago tša PPA go mafolofolo a mitochondrial gomme e gatelela mohola wa dithekniki tša go tšea diswantšho tša go ithuta mekgwa ye e raraganego ya taolo yeo e akaretšwago dikarabelong tša kgateletšego ya mitochondrial.
Mitochondria ke batšwasehlabelo ba bohlokwa mo mešomong ye e fapanego ya disele ka ntle ga dikarolo tša bona tše di tlwaelegilego tšweletšong ya maatla le biosynthesis. Metabolism ya mitochondrial ke molaodi wa bohlokwa wa go laetša khalsiamo, homeostasis ya metaboliki le redox, matshwao a go ruruga, diphetogo tša epigenetic, go ata ga disele, phapano le lehu la sele leo le rulagantšwego1. Ka mo go kgethegilego, metabolism ya mitochondrial e bohlokwa kudu bakeng sa tlhabollo ya di-neuron, go phologa le go šoma gomme e akaretšwa kudu dipontšhong tše di fapa-fapanego tša neuropathology2,3,4.
Mo mengwageng ye lesome ye e fetilego, maemo a metaboliki a tšweletše bjalo ka molaodi wa bogareng wa neurogenesis, phapano, go butšwa le polasetiki5,6. Morago bjale, sebopego sa mitochondria le mafolofolo di fetogile dikarolo tše bohlokwa kudu tša mitosis, e lego tshepedišo e feto-fetogago yeo e bolokago letamo la mitochondria e phetšego gabotse ka gare ga disele. Diphetogo tša mitochondrial di laolwa ke ditsela tše di raraganego tšeo di ithekgilego ka tše dingwe go tloga go biogenesis ya mitochondrial le bioenergetics go ya go karogano ya mitochondrial, go kopanywa, dinamelwa le go tlošwa7,8. Kgatelelo ya efe goba efe ya mekgwa ye ya go kopanya e senya tlhokomelo ya dinetweke tša mitochondrial tše di phetšego gabotse gomme e na le ditlamorago tše di tseneletšego tša mošomo bakeng sa tlhabollo ya ditšhika9,10. Ka nnete, go se laolege ga mafolofolo a mitochondrial go bonwa ka malwetšing a mantši a monagano, a go senyegelwa ke ditšhika le a tlhabollo ya ditšhika, go akaretšwa malwetši a autism spectrum (ASD)11,12.
ASD ke bolwetši bja tšwelopele ya ditšhika bjo bo sa swanego bjo bo nago le mohlwaela wo o raraganego wa leabela le wa epigenetic. Bohwa bja ASD ga bo ganetšwe, eupša etiology ya dimolekule ya motheo e sa dutše e sa kwešišwe gabotse. Go kgoboketša ya data go tšwa go dika tša pele ga kliniki, dithuto tša kliniki, le di-dataset tša dimolekule tša di-omics tše dintši go fa bohlatse bjo bo oketšegago bja go se šome gabotse ga mitochondrial go ASD13,14. Re kile ra dira skrine sa methylation sa DNA sa genome ka bophara sehlopheng sa balwetši bao ba nago le ASD gomme ra hlaola dikarolwana tša leabela tša methylated ka go fapana tšeo di kgobokanego go bapa le ditsela tša metaboliki tša mitochondrial15. Ka morago ga moo re ile ra bega methylation ya phapano ya balaodi ba bogareng ba biogenesis ya mitochondrial le mafolofolo, yeo e bego e tswalanywa le palo ya khopi ya mtDNA ye e oketšegilego le profil ya metaboliki ya moroto ye e fetotšwego ka go ASD16. Datha ya rena e fa bohlatse bjo bo oketšegago bja gore mafolofolo a mitochondrial le homeostasis di kgatha tema ye bohlokwa go pathophysiology ya ASD. Ka gona, go kaonefatša kwešišo ya motšhene ya tswalano magareng ga mafolofolo a mitochondrial, sebopego le mošomo ke pakane e bohlokwa ya nyakišišo e tšwelago pele ya malwetši a methapo ao a hlaolwago ka go se šome gabotse ga mitochondria ga bobedi.
Dithekniki tša dimolekule gantši di dirišetšwa go ithuta tema yeo e kgathwago ke dikarolwana tše itšego tša leabela dikarabelong tša kgateletšego ya mitochondrial. Le ge go le bjalo, mokgwa wo o ka lekanyeditšwe ke tlhago ya mahlakore a mantši le ya nako ya mekgwa ya taolo ya mitotic. Go feta moo, polelo ya phapano ya dikarolwana tša leabela tša mitochondrial ke sešupo se se sa lebanyego sa diphetogo tša mošomo, kudu-kudu ka ge ka tlwaelo e hlahlobja e le palo e lekanyeditšwego feela ya dikarolwana tša leabela. Ka fao, mekgwa ye e lebanyago kudu ya go ithuta mošomo wa mitochondrial le bioenergetics e šišintšwe17. Sebopego sa mitochondrial se amana kudu le mafolofolo a mitochondrial. Sebopego sa mitochondrial, kgokagano, le sebopego di bohlokwa kudu go tšweletšo ya maatla le go phologa ga mitochondrial le sele5,18. Go feta moo, dikarolo tše di fapa-fapanego tša mitosis di lebišitše tlhokomelo diphetogong tša sebopego sa mitochondrial, tšeo di ka šomago e le mafelelo a nago le mohola a go se šome gabotse ga mitochondrial gomme tša nea motheo bakeng sa dinyakišišo tše di latelago tša metšhene.
Sebopego sa mitochondrial se ka bonwa ka go lebanya ka go šomiša microscopy ya elektrone ya phetišetšo (TEM), go dumelela thuto ye e tletšego ya ultrastructure ya sele. TEM ka go lebanya e bona ka leihlo la kgopolo sebopego, sebopego le sebopego sa cristae ya mitochondrial ka tharollo ya mitochondria ka botee, go e na le go ithekga fela ka go ngwalwa ga dikarolwana tša leabela, polelo ya proteine ​​goba ditekanyetšo tša mošomo wa mitochondrial ka gare ga baagi ba disele17,19,20. Go tlaleletša, TEM e nolofatša thuto ya ditirišano magareng ga mitochondria le di-organelle tše dingwe, go swana le reticulum ya endoplasmic le autophagosomes, tšeo di kgathago tema ye bohlokwa mošomong wa mitochondrial le homeostasis21,22. Ka go rialo, se se dira gore TEM e be ntlha e botse ya mathomo bakeng sa go ithuta go se šome gabotse ga mitochondrial pele go lebiša tlhokomelo ditseleng tše itšego goba dikarolwaneng tša leabela. Ge mošomo wa mitochondrial o thoma go ba maleba ka mo go oketšegago go neuropathology, go na le tlhokego ye e kwagalago ya go kgona go ithuta ka go lebanya le ka bontši sebopego sa mitochondrial le mafolofolo ka dikaong tša neuronal tša ka gare ga vitro.
Sehlogong se, re hlahloba mafolofolo a mitochondrial mohlaleng wa neuronal wa go se šome gabotse ga mitochondrial bolwetšing bja sepektheremo sa autism. Re begile peleng methylation ya phapano ya propionyl-CoA carboxylase beta (PCCB) ka go ASD15, e lego yuniti ya ka fasana ya ensaeme ya mitochondrial propionyl-CoA carboxylase PCC. Go se laolege ga PCC go tsebja go hlola go kgoboketšwa ga mpholo ga ditšweletšwa tša propionyl, go akaretšwa esiti ya propionic (PPA)23,24,25. PPA e bontšhitšwe go šitiša metabolism ya neuronal le go fetoša boitshwaro ka vivo gomme ke mohlala wa phoofolo wo o hlomilwego wa go ithuta mekgwa ya neurodevelopmental yeo e amegago go ASD26,27,28. Go tlaleletša, PPA e begilwe go šitiša bokgoni bja lera la mitochondrial, biogenesis le go hema ka vitro gomme e šomišitšwe kudu go dira mohlala wa go se šome gabotse ga mitochondrial ka gare ga dinyurone29,30. Le ge go le bjalo, khuetšo ya go se šome gabotse ga mitochondrial ye e hlotšwego ke PPA go sebopego sa mitochondrial le mafolofolo e sa dutše e sa kwešišwe gabotse.
Thuto ye e šomiša dithekniki tša go tšea diswantšho tša tlaleletšo go lekanyetša ditlamorago tša PPA go sebopego sa mitochondrial, mafolofolo, le mošomo ka diseleng tša SH-SY5Y. Sa pele, re ile ra hlama mokgwa wa TEM go bona ka leihlo la kgopolo diphetogo tša sebopego sa mitochondrial le ultrastructure17,31,32. Ka ge re filwe tlhago ye e fetogago ya mitochondria33, re ile ra šomiša gape le tshekatsheko ya mitochondrial event localizer (MEL) go lekanyetša diphetogo tša tekatekano magareng ga ditiragalo tša go arogana le tša go kopanywa, palo ya mitochondrial le bophagamo ka fase ga kgatelelo ya PPA. Mafelelong, re ile ra hlahloba ge e ba sebopego sa mitochondrial le mafolofolo di tswalanywa le diphetogo tša go bontšhwa ga dikarolwana tša leabela tšeo di akaretšwago go biogenesis, fission le fusion. Ge di tšerwe mmogo, ya data ya rena e bontšha tlhohlo ya go hlakiša go raragana ga mekgwa yeo e laolago mafolofolo a mitochondrial. Re gatelela mohola wa TEM go ithuteng sebopego sa mitochondrial bjalo ka ntlha ya mafelelo ya go kopana ye e ka lekantšhwago ya mitosis ka diseleng tša SH-SY5Y. Go tlaleletša, re gatelela gore datha ya TEM e fa tshedimošo ye e humilego kudu ge e kopantšwe le dithekniki tša go tšea diswantšho tšeo gape di swarago ditiragalo tše di fetogago go arabela kgateletšego ya metaboliki. Go hlalošwa gape ga mekgwa ya taolo ya dimolekule yeo e thekgago mitosis ya disele tša neuronal go ka fa temogo ya bohlokwa ka karolo ya mitochondrial ya tshepedišo ya megalatšhika le malwetši a neurodegenerative.
Go hlohleletša kgateletšego ya mitochondrial, disele tša SH-SY5Y di ile tša alafša ka PPA ka go šomiša 3 mM le 5 mM sodium propionate (NaP). Pele ga TEM, disampole di ile tša bewa ka fase ga go lokišetša sampole ya cryogenic ka go šomiša go gatsela ka kgatelelo ya godimo le go gatsetša (Fig. 1a). Re hlamile phaephe ya tshekatsheko ya seswantšho sa mitochondrial sa go itiriša go ela ditekanyetšo tše seswai tša sebopego sa baagi ba mitochondrial go ralala le diphetolelo tše tharo tša thutaphedi. Re hweditše gore kalafo ya PPA e fetotše kudu ditekanyetšo tše nne: lefelo la 2, lefelo, pherimitha, le bophara bja Feret (Fig. 1b–e). Lefelo la 2 le ile la fokotšega kudu ka bobedi 3 mM le 5 mM PPA kalafo (p = 0.0183 le p = 0.002, ka go latelelana) (Fig. 1b), mola lefelo (p = 0.003), pherimitha (p = 0.0106) le bophara bja Feret ka moka di fokotšegile kudu. Go bile le phokotšo ye kgolo (p = 0.0172) sehlopheng sa kalafo sa 5 mM ge se bapetšwa le sehlopha sa taolo (Fig. 1c–e). Diphokotšo tše bohlokwa tša lefelo le sedikologo di bontšhitše gore disele tšeo di alafilwego ka 5 mM PPA di be di na le di-mitochondria tše nnyane, tše di nkgokolo kudu, le gore di-mitochondria tše di be di sa telele kudu go feta tšeo di lego ka diseleng tša taolo. Se se sepelelana gape le go fokotšega mo gogolo ga bophara bja Feret, e lego paramethara ye e ikemetšego yeo e laetšago go fokotšega ga sekgala se segolo magareng ga mapheko a dikarolwana. Diphetogo ka ultrastructure ya cristae di ile tša bonwa: cristae e ile ya ba ka fase ga go bonagala ka fase ga khuetšo ya kgatelelo ya PPA (Fig. 1a, phanele B). Le ge go le bjalo, ga se diswantšho ka moka tšeo di bego di bontšha gabotse ultrastructure ya cristae, ka fao tshekatsheko ya boleng ya diphetogo tše ga se ya dirwa. Datha ye ya TEM e ka bontšha maemo a mararo ao a kgonegago: (1) PPA e godiša go arogana goba e thibela go kopanywa, e dira gore mitochondria yeo e lego gona e fokotšege ka bogolo; (2) biogenesis e matlafaditšwego e hlola mitochondria e mpsha, e nyenyane goba (3) e hlohleletša mekgwa ye ka bobedi ka nako e tee. Le ge e le gore maemo a a ka se hlaolwe ka TEM, diphetogo tše bohlokwa tša sebopego di laetša diphetogo tša homeostasis ya mitochondrial le mafolofolo ka fase ga kgatelelo ya PPA. Ka morago ga moo re ile ra hlahloba ditekanyetšo tša tlaleletšo go hlaola gape mafolofolo a le mekgwa yeo e ka bago gona yeo e lego motheo wa ona.
Esiti ya propionic (PPA) e lokiša sebopego sa mitochondrial. (a) Diswantšho tša microscopy ya elektrone ya phetišetšo ya baemedi (TEM) tšeo di bontšhago gore bogolo bja mitochondria bo a fokotšega gomme mitochondria e ba ye nnyane le go ba nkgokolo kudu ka kalafo ya PPA ye e oketšegago; 0 mM (e sa alafšago), 3 mM le 5 mM, ka go latelelana. Metsu e mefubelu e bontša mitochondria. (b–e) SH-SY5Y lisele tse tšoaroa ka PPA bakeng sa 24 h ba ile ba lokisetsa bakeng sa TEM le diphetho ba ile ba sekaseka sebelisa Fiji / ImageJ. Ditekanyetšo tše nne go tše seswai di bontšhitše diphapano tše bohlokwa magareng ga disele tša taolo (tše di sa alafšego, 0 mM PPA) le tše di alafilwego (3 mM le 5 mM PPA). (b) Selete sa 2, (c) Sebaka, (d) Pherimitha, (e) Bophara bja feret. Tshekatsheko ya tsela e tee ya phapano (taolo vs. kalafo) le teko ya go bapetša ya Dunnett ye ntši di ile tša šomišwa go bona diphapano tše bohlokwa (p <0.05). Dintlha tša datha di emela boleng bja mitochondrial bja karolelano bja sele ye nngwe le ye nngwe ka noši, gomme dibara tša phošo di emela magareng ± SEM. Data e bontšhitšwego e emela n = 3, bonyane disele tše 24 ka phetolelo; palomoka ya diswantšho tše 266 di ile tša hlahlobja; * e bontšha p <0.05, ** e bontšha p <0.01.
Go tšwela pele go hlaola kamoo mafolofolo a mitochondrial a arabelago PPA, re ile ra šilafatša mitochondria ka tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) gomme ra diriša microscopy ya go feta ya nako le tshekatsheko ya MEL go beakanya le go lekanyetša mitochondria ka morago ga diiri tše 24 ka 3 le 5 mM PPA. Kalafo ya ditiragalo tša go arogana le tša go kopanywa. (Setshwantsho. 2a). Ka morago ga tshekatsheko ya MEL, mitochondria e ile ya sekaseka gape go lekanyetša palo ya dibopego tša mitochondrial le bophagamo bja tšona bja palogare. Re ile ra bona koketšego e nyenyane eupša e kgolo ya palo ya ditiragalo tša go arogana tšeo di diregago ka 3 mM [4.9 ± 0.3 (p <0.05)] ge e bapetšwa le go arogana [5.6 ± 0.3 (p <0.05) )] le go kopanywa [5.4 ± 0.5 (p <0.05)] le go kopanywa [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] <0.05)] ditiragalo di ile tša oketšega kudu ka 5 mM ge di bapetšwa le taolo (Fig. 3b). Palo ya mitochondria e ile ya oketšega kudu ka bobedi 3 [32.6 ± 2.1 (p <0.05)] le 5 mM [34.1 ± 2.2 (p <0.05)] (Fig. 3c) , mola karolelano ya bophagamo bja sebopego se sengwe le se sengwe sa mitochondria e ile ya dula e sa fetoge (Fig. 3c). 3d). Ge di tšerwe mmogo, se se šišinya gore go bopša gape ga mafolofolo a mitochondrial go šoma bjalo ka karabelo ya go lefela yeo e bolokago ka katlego botshepegi bja netweke ya mitochondrial. Koketšego ya palo ya ditiragalo tša go arogana ka 3 mM PPA e šišinya gore koketšego ya palo ya mitochondrial e bakwa ka karolo ya go arogana ga mitochondrial, eupša ge go fiwa gore palogare ya bophagamo bja mitochondrial e dula e sa fetoge gabotse, biogenesis e ka se lahlwe bjalo ka karabelo ya tlaleletšo ya go lefela. Le ge go le bjalo, ya data ye e sepelelana le dibopego tše nnyane, tša nkgokolo tša mitochondrial tšeo di hlokometšwego ke TEM gomme gape di bontšha diphetogo tše bohlokwa ka go mafolofolo a mitochondrial ao a hlohleleditšwego ke PPA.
Esiti ya propionic (PPA) e hlohleletša go fetošwa ga mitochondrial mo go fetogago go boloka botshepegi bja netweke. Disele tša SH-SY5Y di ile tša godišwa, tša alafša ka 3 le 5 mM PPA ka diiri tše 24 gomme tša tšhilafatšwa ka TMRE le Hoechst 33342 gomme tša latelwa ke tshekatsheko ya MEL. (a) Moemedi nako-lapse microscopy diswantšho bontša mmala le binarized palo e kahodimodimo matla ditekanyetso ka nako 2 (t2) bakeng sa boemo bo mong le e mong. Dilete tše di kgethilwego tšeo di bontšhitšwego seswantšhong se sengwe le se sengwe sa binary di a godišwa le go bontšhwa ka 3D ka diforeime tše tharo tša nako tše di fapanego (t1-t3) go bontšha mafolofolo ge nako e dutše e eya; ditiragalo tša go kopanywa di hlaolwa ka botala; ditiragalo tša go arogana di hlaolwa ka botala. E bontšhitšwe ka mmala wo mohwibidu. (b) Palogare ya palogare ya ditiragalo tše di fetogago ka seemo. (c) Palogare ya dibopego tša mitochondrial ka sele. (d) Palogare ya bophagamo (μm3) ya sebopego se sengwe le se sengwe sa mitochondrial ka sele. Data e bontšhitšwego ke moemedi wa n = 15 disele ka sehlopha sa kalafo. Dibara tša phošo tše di bontšhitšwego di emela magareng ± SEM, tekanyo ya baara = 10 μm, * p <0.05.
Esiti ya propionic (PPA) e hlola go gatelela ga transcriptional ga dikarolwana tša leabela tšeo di amanago le mafolofolo a mitochondrial. Disele tša SH-SY5Y di ile tša alafša ka 3 le 5 mM PPA ka 24 h. Go lekanyetša dikarolwana tša leabela tša go lekana go dirilwe ka go šomiša RT-qPCR gomme ya tlwaetšwa go B2M. Dipshio tša biogenesis ya mitochondrial (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 le (d) NFE2L2. Dipshio tša go kopanywa le tša go arogana ga mitochondrial (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 le (i) DRP1. Diphapano tše bohlokwa (p <0.05) di ile tša lekwa ka go šomiša ANOVA ya tsela e tee (taolo vs. kalafo) le teko ya go bapetša ya Dunnett ye ntši: * e bontšha p <0.05, ** e bontšha p <0.01, gomme **** e bontšha p <0.0001. Bars emela polelo bolela ± SEM. Data e bontšhitšwego e emela n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), le n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) diphetolelo tša diphedi.
Data go tšwa go ditshekatsheko tša TEM le MEL mmogo e laetša gore PPA e fetoša sebopego sa mitochondrial le mafolofolo. Lega go le bjalo, mekgwa ye ya go tšea diswantšho ga e nee temogo ya mekgwa yeo e lego motheo yeo e sepedišago ditshepedišo tše. Ka fao re ile ra hlahloba polelo ya mRNA ya balaodi ba senyane ba bohlokwa ba mafolofolo a mitochondrial, biogenesis, le mitosis go arabela kalafo ya PPA. Re ile ra quantified sele myeloma oncogene (cMYC), nyutlelie hema Ntlha (NRF1), mitochondrial transcription Ntlha 1 (TFAM), NFE2-joaloka transcription Ntlha BZIP (NFE2L2), gastrin-joaloka protheine 2 (STOML2), optic methapo ea methapo atrophy 1 (OPA1 ), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) le proteine ​​ye e amanago le dynamin 1 (DRP1) ka morago ga diiri tše 24 tša kalafo ka 3 mM le 5 mM PPA. Re ile ra hlokomela 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 le p <0.0001, ka ho latellana) le 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p <0.0001) PPA kalafo. (Setšoantšo. 3a–c). Phokotšego ya polelo ya mRNA e be e ithekgile ka tekanyo: polelo ya cMYC, NRF1 le TFAM e ile ya fokotšega ka makga a 5.7, 2.6 le 1.9 ka 3 mM, ka go latelelana, le ka makga a 11.2, 3 le 2.2 ka 5 mM. Ka go fapana, lephelo la bogareng bja redox biogenesis NFE2L2 ga se ya fetošwa ka mahloriso afe goba afe a PPA, le ge e le gore tshekamelo ye e swanago ye e ithekgilego ka tekanyo ya go fokotšega ga polelo e ile ya bonwa ( Seswantšho 3d ).
Re ile ra hlahloba gape le polelo ya dikarolwana tša leabela tša kgale tšeo di akaretšwago taolong ya go arogana le go kopanywa. STOML2 e naganwa gore e amega ka go kopanywa, mitophagy le biogenesis, gomme polelo ya yona e ile ya fokotšwa kudu (p <0.0001) ka 3 mM (phetogo ya makga a 2.4) le 5 mM (phetogo ya makga a 2.8) PPA (Fig. 1). 3d). Ka mo go swanago, OPA1 fusion dikarolwana tša leabela polelo e ile ya fokotšega ka 3 mM (phetogo ya makga a 1.6) le 5 mM (phetogo ya makga a 1.9) PPA (p = 0.006 le p = 0.0024, ka go latelelana) (Fig. 3f). Le ge go le bjalo, ga se ra hwetša diphapano tše bohlokwa ka polelo ya dikarolwana tša leabela tša go kopanywa MFN1, MFN2 goba dikarolwana tša leabela tša go arogana DRP1 ka fase ga kgatelelo ya 24-h PPA (Fig. 3g–i). Go tlaleletša, re hweditše gore maemo a diprotheine tše nne tša go kopanywa le tša go arogana (OPA1, MFN1, MFN2 le DRP1) ga se a fetoga ka fase ga maemo a swanago (Fig. 4a–d). Go bohlokwa go lemoga gore datha ye e bontšha ntlha e tee ya nako gomme e ka no se bontšhe diphetogo tša polelo ya proteine ​​goba maemo a mošomo nakong ya dikgato tša mathomo tša kgateletšego ya PPA. Le ge go le bjalo, diphokotšo tše kgolo tša polelo ya cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, le OPA1 di bontšha go se laolege mo gogolo ga transcriptional ga metabolism ya mitochondrial, biogenesis, le mafolofolo. Go tlaleletša, ya data ye e gatelela mohola wa dithekniki tša go tšea diswantšho go ithuta ka go lebanya diphetogo tša maemo a mafelelo mošomong wa mitochondrial.
Maemo a proteine ​​ya fusion le fission factor ga se a fetoga ka morago ga kalafo ya esiti ya propionic (PPA). Disele tša SH-SY5Y di ile tša alafša ka 3 le 5 mM PPA ka 24 h. Maemo a proteine ​​a ile a balwa ka tshekatsheko ya Western blot, gomme maemo a polelo a ile a tlwaetšwa go palomoka ya proteine. Palogare ya polelo ya proteine ​​le moemedi wa Western blots ya nepišo le palomoka ya proteine ​​di bontšhwa. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Bars emela bolela ± SEM, le ya data bontšitsoeng ke moemeli oa n = 3 phetolelo thutaphedi. Dipapišo tše ntši (p <0.05) di dirilwe ka go šomiša tshekatsheko ya tsela e tee ya phapano le teko ya Dunnett. Gel ya mathomo le blot di bontšhitšwe mo Seswantšhong sa S1.
Go se šome gabotse ga mitochondrial go tswalanywa le malwetši a ditshepedišo tše dintši go tloga go malwetši a metaboliki, a pelo le mešifa go ya go malwetši a methapo1,10. Malwetši a mantši a go senyegelwa ke ditšhika le a go senyegelwa ke ditšhika a tswalanywa le go se šome gabotse ga mitochondrial, e lego seo se gatelelago bohlokwa bja ditho tše nakong ka moka ya bophelo bja bjoko. Malwetši a a akaretša bolwetši bja Parkinson, bolwetši bja Alzheimer le ASD3,4,18. Lega go le bjalo, go fihlelela ditlhalenama tša bjoko bakeng sa go ithuta malwetši a go thata, kudu-kudu maemong a metšhene, e lego seo se dirago gore ditshepedišo tša mohlala wa disele e be selo se sengwe seo se nyakegago. Thutong ye, re šomiša tshepedišo ya mohlala wa disele re šomiša disele tša SH-SY5Y tšeo di alafilwego ka PPA go akaretša gape go se šome gabotse ga mitochondrial mo go lemogilwego malwetšing a di-neuron, kudukudu malwetši a sepektheremo sa autism. Go šomiša mohlala wo wa PPA go ithuta mafolofolo a mitochondrial ka di-neuron go ka fa temogo ya etiology ya ASD.
Re ile ra hlahloba kgonagalo ya go šomiša TEM go lebelela diphetogo tša sebopego sa mitochondrial. Go bohlokwa go lemoga gore TEM e swanetše go šomišwa ka nepagalo go godiša go šoma gabotse ga yona. Go lokišetša dipeelano tša cryo go dumelela pabalelo ye kaone ya dibopego tša di-neuron ka go lokiša dikarolo tša disele ka nako e tee le go fokotša go bopša ga dilo tša kgale34. Go sepelelana le se, re lemogile gore disele tša SH-SY5Y tša go swana le neuron di be di na le di-organelle tša ka fase ga sele tše di sa senyegago le mitochondria ye e telele ( Seswantšho 1a ). Se se gatelela mohola wa dithekniki tša go lokišetša cryogenic bakeng sa go ithuta sebopego sa mitochondrial dikaong tša disele tša neuronal. Le ge e le gore dikelo tša boleng di bohlokwa kudu bakeng sa tshekatsheko ya maikemišetšo ya datha ya TEM, go sa dutše go se na kwano ya gore ke ditekanyetšo dife tše itšego tšeo di swanetšego go lekantšhwa go tiišetša diphetogo tša sebopego sa mitochondrial. Thehiloeng palo e khōlō ea lithuto hore ba quantitatively hlahloba mitochondrial sebopeho17,31,32, re ntshetswa pele mitochondrial setšoantšo and analysis pipeline e jarolla ka ho iketsa hore lekanya ditekanyetos robeli sebopeho, e leng: sebakeng seo, area2, karo-karolelano ya lehlakore, pherimitha, sedikadikwe, tekanyo , Feret bophara. le go ba ga nkgokolo.
Gare ga bona, PPA e ile ya fokotša kudu lefelo la 2, lefelo, pherimitha, le bophara bja Feret (Fig. 1b–e). Se se bontšhitše gore mitochondria e ile ya ba ye nnyane le go ba nkgokolo, e lego seo se sepelelanago le dinyakišišo tša peleng tšeo di bontšhago go fokotšega ga lefelo la mitochondria ka morago ga diiri tše 72 tša kgateletšego ya mitochondria yeo e hlotšwego ke PPA30. Dikarolo tše tša sebopego di ka laetša go arogana ga mitochondrial, e lego tshepedišo ye e nyakegago ya go kgaola dikarolo tše di senyegilego go tšwa go netweke ya mitochondrial go tšwetša pele go senyega ga tšona ka mitophagy35,36,37. Ka lehlakoreng le lengwe, go fokotšega ga bogolo bja mitochondrial bja palogare go ka tswalanywa le go oketšega ga biogenesis, yeo e feleletšago ka go bopša ga mitochondria e nyenyane yeo e sa tšwago go thoma. Koketšego ya karogano goba biogenesis e emela karabelo ya go lefela go hlokomela mitosis kgahlanong le kgateletšego ya mitochondrial. Lega go le bjalo, go fokotšega ga kgolo ya mitochondria, go senyegelwa ke go kopanywa goba maemo a mangwe a ka se kgaphelwe ka ntle.
Le ge e le gore diswantšho tša tharollo ya godimo tšeo di hlotšwego ke TEM di dumelela go ikemišetša ga dimelo tša sebopego maemong a mitochondria ka botee, mokgwa wo o tšweletša diswantšho tša mahlakore a mabedi ka nako e tee. Go ithuta dikarabelo tše di fetogago go kgateletšego ya metaboliki, re ile ra šilafatša mitochondria ka TMRE gomme ra diriša microscopy ya nako-lapse ka tshekatsheko ya MEL, yeo e dumelelago pono ya 3D ya go feta ya godimo ya diphetogo tša netweke ya mitochondrial ka nako33,38. Re ile ra bona diphetogo tše di sa lemogegego eupša tše bohlokwa ka go mafolofolo a mitochondrial ka tlase ga kgateletšego ya PPA ( Seswantšho 2 ). Ka 3 mM, palo ya ditiragalo tša go arogana e oketšegile kudu, mola ditiragalo tša go kopanywa di ile tša dula di swana le ka taolo. Koketšego ya palo ya bobedi ditiragalo tša go arogana le tša go kopanywa e ile ya bonwa ka 5 mM PPA, eupša diphetogo tše di be di lekana, e šišinya gore kinetics ya go arogana le ya go kopanywa di fihlelela tekatekano ka mahloriso a godimo (Fig. 2b). Palogare ya bophagamo bja mitochondrial e ile ya dula e sa fetoge ka bobedi 3 le 5 mM PPA, e bontšha gore botshepegi bja netweke ya mitochondrial bo ile bja bolokwa (Fig. 2d). Se se laetša bokgoni bja dinetweke tša mitochondrial tše di fetogago go arabela kgateletšego ye bonolo ya metaboliki go hlokomela homeostasis ka mo go atlegilego ntle le go hlola go arogana ga dinetweke. Ka 3 mM PPA, koketšego ya karogano e lekane go tšwetša pele phetogo go ya go tekatekano ye mpsha, eupša go nyakega lefsa ga kinetic mo go tseneletšego kudu go arabela kgateletšego yeo e hlohleletšwago ke ditekanyetšo tše di phagamego tša PPA.
Palo ya mitochondria e ile ya oketšega ka bobedi PPA kgatelelo ya monagano mahloriso, eupša karolelano bophagamo mitochondrial bophagamo ga se ya fetoga kudu (Fig. 2c). Se se ka ba ka lebaka la go oketšega ga biogenesis goba go oketšega ga karogano; le ge go le bjalo, ka go se be gona ga go fokotšega mo gogolo ga bophagamo bja mitochondrial bja magareng, go na le kgonagalo ye kgolo ya gore biosynthesis e oketšege. Le ge go le bjalo, ya data yeo e lego go Seswantšho 2 e thekga go ba gona ga mekgwa ye mebedi ya go lefela: koketšego ya palo ya ditiragalo tša go arogana, yeo e sepelelanago le upregulation ya go arogana ga mitochondrial, le koketšego ya palo ya ditiragalo, yeo e sepelelanago le biogenesis ya mitochondrial. Mafelelong, tefo e matla bakeng sa kgateletšego e bonolo e ka ba le ditshepedišo tša nako e tee tšeo di akaretšago go arogana, go kopanywa, biogenesis le mitophagy. Le ge e le gore bangwadi ba peleng ba bontšhitše gore PPA e godiša mitosis30,39 le mitophagy29, re fa bohlatse bja go bopa gape ga karogano ya mitochondrial le mafolofolo a go kopanywa go arabela PPA. Datha ye e tiišetša diphetogo tša sebopego tšeo di hlokometšwego ke TEM gomme e fa temogo ye nngwe ka ga mekgwa yeo e amanago le go se šome gabotse ga mitochondrial mo go hlotšwego ke PPA.
Ka ge tshekatsheko ya TEM goba MEL ga se ya nea bohlatse bjo bo lebanyago bja mekgwa ya taolo ya dikarolwana tša leabela yeo e lego motheo wa diphetogo tše di hlokometšwego tša sebopego, re ile ra hlahloba polelo ya RNA ya dikarolwana tša leabela tšeo di akaretšwago metabolism ya mitochondrial, biogenesis le mafolofolo. Proto-oncogene ya cMYC ke selo sa go ngwalolla seo se amegago ka taolo ya mitochondria, glycolysis, amino acid le metabolism ya esiti ya makhura40. Go tlaleletša, cMYC e tsebja ka go laola polelo ya dikarolwana tša leabela tša mitochondrial tše di nyakilego go ba 600 tšeo di akaretšwago go ngwaleng ga mitochondrial, phetolelo le kopanong ye e raraganego, go akaretšwa NRF1 le TFAM41. NRF1 le TFAM ke balaodi ba babedi ba bogareng ba mitosis, ba šoma ka tlase ga noka ya PGC-1α go dira gore mtDNA phetolelo e šome. Tsela ye e šomišwa ke cAMP le AMPK signaling gomme e na le kwelobohloko go tšhomišo ya maatla le kgateletšego ya metaboliki. Re ile ra hlahloba gape NFE2L2, e lego molaodi wa redox wa biogenesis ya mitochondrial, go bona ge e ba ditlamorago tša PPA di ka ba di tsenywa gare ke kgateletšego ya oxidative.
Le ge e le gore polelo ya NFE2L2 e ile ya dula e sa fetoge, re hweditše go fokotšega mo go sa fetogego mo go ithekgilego ka tekanyo ya polelo ya cMYC, NRF1 le TFAM ka morago ga 24 h ya kalafo ka 3 mM le 5 mM PPA (Fig. 3a-c). Downregulation ya polelo ya cMYC e begilwe peleng bjalo ka karabelo ya kgateletšego ya mitochondrial42, gomme ka lehlakoreng le lengwe, downregulation ya polelo ya cMYC e ka hlola go se šome gabotse ga mitochondrial ka go remodeling metabolism ya mitochondrial, kgokagano ya netweke, le polarization ya lera43. Se se kgahlišago ke gore cMYC e amega gape ka taolo ya go arogana ga mitochondrial le go kopanywa42,43 gomme e tsebja ka go oketša phosphorylation ya DRP1 le go bewa ga mitochondrial selegae nakong ya karoganyo ya disele44, gammogo le go tsena gare ga go fetošwa ga sebopego sa mitochondrial ka diseleng tša kutu tša neuronal45. Ka kgonthe, di-fibroblast tšeo di hlaelelago cMYC di bontšha bogolo bjo bo fokotšegilego bja mitochondrial, bjo bo dumelelanago le diphetogo tšeo di hlohleletšwago ke kgateletšego ya PPA43. Datha ye e bontšha kamano ye e kgahlišago eupša yeo e sa hlakago magareng ga cMYC le mafolofolo a mitochondrial, e fa nepišo ye e kgahlišago ya dithuto tša ka moso tša go bopa leswa mo go hlotšwego ke kgateletšego ya PPA.
Phokotšo ya NRF1 le TFAM e sepelelana le tema ya cMYC bjalo ka sedirišwa sa bohlokwa sa transcriptional activator. Datha ye e dumelelana gape le dinyakišišo tša peleng ka diseleng tša kankere ya mala a batho tšeo di bontšhago gore PPA e fokoditše polelo ya NRF1 mRNA ka diiri tše 22, yeo e bego e tswalanywa le go fokotšega ga ATP le go oketša ROS46. Bangwadi ba ba begile gape gore polelo ya TFAM e oketšegile ka diiri tše 8.5 eupša ya boela maemong a motheo ka diiri tše 22. Ka go fapana, Kim et al. (2019) o bontšhitše gore polelo ya TFAM mRNA e ile ya fokotšega kudu ka morago ga 4 h ya kgateletšego ya PPA ka diseleng tša SH-SY5Y; le ge go le bjalo, ka morago ga diiri tše 72, polelo ya proteine ​​ya TFAM e ile ya oketšega kudu gomme palo ya khopi ya mtDNA e ile ya oketšega kudu. Ka go realo, go fokotšega ga palo ya dikarolwana tša leabela tša biogenesis tša mitochondrial tšeo re di bonego ka morago ga diiri tše 24 ga go kgapele ntle kgonagalo ya gore koketšego ya palo ya mitochondria e tswalanywa le go tsenywa tirišong ga biogenesis dintlheng tša nako ya peleng. Dinyakišišo tša peleng di bontšhitše gore PPA e upregulates kudu PGC-1α mRNA le proteine ​​ka diseleng tša SH-SY5Y ka diiri tše 4 metsotso ye 30, mola esiti ya propionic e godiša biogenesis ya mitochondrial ka go di-hepatocyte tša namane ka PGC-1α ka diiri tše 12 metsotso ye 39. Se se kgahlišago ke gore PGC-1α ga se fela molaodi wa transcriptional wa thwii wa NRF1 le TFAM, eupša gape e bontšhitšwe go laola mošomo wa MFN2 le DRP1 ka go laola fission le fusion47. Ge di tšerwe mmogo, se se gatelela kopanyo ya kgauswi ya mekgwa yeo e laolago dikarabelo tša tefo ya mitochondrial tšeo di hlohleletšwago ke PPA. Go feta fao, ya data ya rena e bontšha dysregulation ye bohlokwa ya taolo ya transcriptional ya biogenesis le metabolism ka fase ga kgatelelo ya PPA.
Dipshio tša STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 le DRP1 di gare ga balaodi ba bogareng ba karogano ya mitochondrial, kopanyo le mafolofolo37,48,49. Go na le dikarolwana tše dingwe tše ntši tša leabela tšeo di amegago go mafolofolo a mitochondrial, le ge go le bjalo, STOML2, OPA1 le MFN2 di hweditšwe peleng di na le methylated ka go fapana ka dihlopha tša ASD,16 gomme dinyakišišo tše mmalwa tše di ikemetšego di begile diphetogo ka mabaka a a go ngwalolla go arabela kgateletšego ya mitochondrial50,51. 52. Polelo ya bobedi OPA1 le STOML2 e ile ya fokotšwa kudu ka 3 mM le 5 mM PPA kalafo (Fig. 3e, f). OPA1 ke e nngwe ya balaodi ba classical ba kopanyo ya mitochondrial ka tirišano ya thwii le MFN1 le 2 gomme e kgatha tema go cristae remodeling le mitochondrial morphology53. Karolo e nepagetšego ya STOML2 go mafolofolo a mitochondrial e sa dutše e sa hlaka, eupša bohlatse bo šišinya gore e kgatha tema go kopanyeng ga mitochondrial, biogenesis le mitophagy.
STOML2 e amega go hlokomela kopanyo ya go hema ya mitochondrial le go bopša ga dikomponi tša ketane ya go hema54,55 gomme e bontšhitšwe go fetoša kudu dimelo tša metaboliki tša disele tša kankere56. Dinyakišišo di bontšhitše gore STOML2 e kgothaletša bokgoni bja lera la mitochondrial le biogenesis ka tirišano le BAN le cardiolipin 55, 57, 58. Go tlaleletša, dinyakišišo tše di ikemetšego di bontšhitše gore tirišano magareng ga STOML2 le PINK1 e laola mitophagy59,60. Ka mo go lemogegago, STOML2 e begilwe go dirišana thwii le le go tsepamiša MFN2 gomme gape e kgatha tema ye bohlokwa go tsepamiša di-isoform tše telele tša OPA1 ka go thibela protease yeo e ikarabelago ka go senyega ga OPA153,61,62. Phokotšo ya polelo ya STOML2 yeo e hlokometšwego ka dikarabelong tša PPA e ka dira gore diproteine ​​tše tša go kopanywa di be kotsing kudu ya go senyega ka ditsela tše di ithekgilego ka ubiquitin le proteasome48. Le ge e le gore tema ye e nepagetšego ya STOML2 le OPA1 karabelong ye e fetogago go PPA ga e hlake, go fokotšega ga polelo ya dikarolwana tše tša leabela tša go kopanywa (Setshwantšho 3) go ka šitiša tekatekano magareng ga go arogana le go kopanywa gomme gwa lebiša go fokotšegeng ga bogolo bja mitochondrial (Setshwantšho 3). 1).
Ka lehlakoreng le leng, OPA1 protheine polelo lula sa fetoha ka mor'a 24 h, ha mRNA le maemo a protheine ya MFN1, MFN2 kapa DRP1 ha aa ka a fetola haholo ka mor'a PPA kalafo (Fig. 3g-i, Fig. 4). Se se ka laetša gore ga go na diphetogo taolong ya mabaka a ao a akaretšwago go kopanyeng le go arogana ga mitochondrial. Lega go le bjalo, go bohlokwa go lemoga gore e nngwe le e nngwe ya dikarolwana tše tše nne tša leabela e laolwa gape ke diphetogo tša ka morago ga go ngwalwa (PTM) tšeo di laolago modiro wa diprotheine. OPA1 e na le diphetogo tše seswai tše dingwe tša splice tšeo di arotšwego ka proteolytically ka gare ga mitochondria go tšweletša di-isoform tše pedi tše di fapanego 63 . Tekatekano magareng ga di-isoform tše telele le tše kopana mafelelong e laola tema ya OPA1 ka go kopanywa ga mitochondrial le tlhokomelo ya netweke ya mitochondrial64. Mošomo wa DRP1 o laolwa ke phosphorylation ya proteine ​​kinase II (CaMKII) yeo e ithekgilego ka khalsiamo/calmodulin, mola go senyega ga DRP1 go laolwa ke ubiquitination le SUMOylation65. Mafelelong, bobedi DRP1 le MFN1/2 ke di-GTPase, ka gona mošomo o ka tutuetšwa ke tekanyo ya tšweletšo ya GTP ka gare ga mitochondria 66 . Ka fao, le ge e le gore polelo ya diproteine ​​tše e dula e sa fetoge, se se ka no se bontšhe mošomo wa diproteine ​​wo o sa fetogego goba go bewa ga lefelo67,68. Ka kgonthe, di- repertoire tša diprotheine tša PTM tšeo di lego gona gantši di šoma e le mothaladi wa pele wa tšhireletšo wo o ikarabelago ka go tsena gare ga dikarabelo tša kgateletšego e šoro. Ka go ba gona ga kgateletšego ya metaboliki ye e lekanetšego mohlaleng wa rena, go na le kgonagalo ya gore PTM e kgothaletša mošomo wo o oketšegilego wa diproteine ​​tša go kopanya le tša go arogana go bušetša ka mo go lekanego botshepegi bja mitochondrial ntle le go nyaka go tsenywa tirišong ga tlaleletšo ga dikarolwana tše tša leabela maemong a mRNA goba proteine.
Ge di tšerwe mmogo, ya data ye e lego ka mo godimo e gatelela taolo ye e raraganego le ye e ithekgilego ka nako ya sebopego sa mitochondrial le ditlhohlo tša go hlakiša mekgwa ye. Go ithuta polelo ya dikarolwana tša leabela, go nyakega pele go hlaola dikarolwana tša leabela tše itšego tšeo di lebantšwego tseleng. Lega go le bjalo, tsebišo ya rena e bontšha gore dikarolwana tša leabela tšeo di lego tseleng e swanago ga di arabele ka tsela e swanago kgateletšegong e swanago. Go bolela nnete, dinyakišišo tša peleng di bontšhitše gore dikarolwana tša leabela tše di fapanego tseleng e tee di ka bontšha diprofaele tša karabelo ya nako tše di fapanego30,46. Go oketša moo, go na le mekgwa e raraganego ya ka morago ga go ngwalolla yeo e šitišago tswalano magareng ga go ngwalolla le go šoma ga dikarolwana tša leabela. Dinyakišišo tša proteomic di ka fa temogo ya khuetšo ya di-PTM le mošomo wa proteine, eupša gape di hlola ditlhohlo go akaretšwa mekgwa ya go tšweletša ya fase, ditekanyo tša godimo tša leswao go lešata, le tharollo ye mpe.
Ka seemo se, go ithuta sebopego sa mitochondrial ka go šomiša TEM le MEL go na le bokgoni bjo bogolo bja go rarolla dipotšišo tša motheo mabapi le kamano magareng ga mafolofolo a mitochondrial le mošomo le ka fao se se tutuetšago bolwetši. Sa bohlokwa kudu, TEM e fa mokgwa wa thwii wa go ela sebopego sa mitochondrial bjalo ka ntlha ya mafelelo ye e kopanago ya go se šome gabotse ga mitochondrial le mafolofolo51. MEL e fana gape ka mokgwa wa thwii wa go bona ka leihlo la kgopolo ditiragalo tša go arogana le tša go kopanywa tikologong ya disele tša mahlakore a mararo, go dumelela go lekanyetša boleng bja go fetošwa ga mitochondrial ye e fetogago le ge go se na diphetogo tša polelo ya dikarolwana tša leabela33. Mona re gatelela mohola wa dithekniki tša go tšea diswantšho tša mitochondrial malwetšing a bobedi a mitochondrial. Malwetši a ka tlwaelo a hlaolwa ka kgateletšego e sa folego e bonolo ya metaboliki yeo e hlaolwago ka go bopša lefsa mo go sa lemogegego ga dinetweke tša mitochondrial go e na le tshenyo e šoro ya mitochondrial. Lega go le bjalo, tefo ya mitochondrial yeo e nyakegago bakeng sa go boloka mitosis ka tlase ga kgateletšego e sa folego e na le ditla-morago tše di tseneletšego tša mošomo. Ka gare ga seemo sa thutamahlale ya ditšhika, kwešišo ye kaone ya mekgwa ye ya go lefela e ka fa tshedimošo ye bohlokwa mabapi le pleiotropic neuropathology yeo e amanago le go se šome gabotse ga mitochondrial.
Mafelelong, ya data ya rena e gatelela mohola wa dithekniki tša go tšea diswantšho bakeng sa go kwešiša ditlamorago tša mošomo tša ditirišano tše di raraganego magareng ga polelo ya dikarolwana tša leabela, diphetogo tša proteine ​​le mošomo wa proteine ​​yeo e laolago mafolofolo a mitochondrial ya neuronal. Re ile ra diriša PPA go dira mohlala wa go se šome gabotse ga mitochondrial mohlaleng wa sele ya neuronal go hwetša temogo ya karolo ya mitochondrial ya ASD. Disele tša SH-SY5Y tšeo di alafilwego ka PPA di bontšhitše diphetogo tša sebopego sa mitochondria: mitochondria e ile ya ba ye nnyane le ya nkgokolo, gomme di-cristae di be di sa hlalošwa gabotse ge di hlokometšwe ka TEM. Tshekatsheko ya MEL e bontšha gore diphetogo tše di direga ka nako e tee le koketšego ya ditiragalo tša go arogana le tša go kopanywa go hlokomela netweke ya mitochondrial go arabela kgateletšego ye bonolo ya metaboliki. Go feta moo, PPA e šitiša kudu taolo ya transcriptional ya metabolism ya mitochondrial le homeostasis. Re ile ra hlwaya cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, le OPA1 bjalo ka balaodi ba bohlokwa ba mitochondrial bao ba šitišitšwego ke kgateletšego ya PPA gomme ba ka kgatha tema go tsena gare ga diphetogo tšeo di hlotšwego ke PPA ka sebopegong le mošomong wa mitochondrial. Dinyakišišo tša ka moso di a nyakega go hlaola gakaone diphetogo tša nako tšeo di hlotšwego ke PPA ka go polelo ya dikarolwana tša leabela le mošomong wa proteine, go bewa ga selegae, le diphetogo tša ka morago ga phetolelo. ya data ya rena e gatelela go raragana le go ithekga ga mekgwa ya taolo yeo e tsenago gare ga karabelo ya kgateletšego ya mitochondrial gomme e bontšha mohola wa TEM le dithekniki tše dingwe tša go tšea diswantšho bakeng sa dithuto tša metšhene tše di nepišitšwego kudu.
Mothaladi wa sele ya SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) o rekilwe go tšwa go Sigma-Aldrich. Disele tša SH-SY5Y di ile tša bjalwa ka gare ga motswako wa phepo ya Eagle’s medium/F-12 ye e fetotšwego ya Dulbecco (DMEM/F-12) le L-glutamine (SC09411, ScienCell) ka gare ga diflask tša 25 cm2 tšeo di tlaleleditšwego ka 20% ya serum ya kgomo ya fetus (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) le 1% ya penicillin-streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) ka 37 °C, 5% ya CO2. Disele di ile tša subcultured go fihla go 80% ya go kopana ka go šomiša 0.05% ya trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), ya centrifuged ka 300 g gomme ya poleitiwa ka segokanyipalo sa disele tše ka bago 7 × 105/ml. Diteko ka moka di dirilwe ka disele tša SH-SY5Y tšeo di sa fapanego magareng ga ditemana 19-22. PPA e laolwa bjalo ka NaP. Qhibidiša phofo ya NaP (CAS No. 137-40-6, formula ya dikhemikhale C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) ka meetseng a borutho a MilliQ go fihla go mahloriso a 1 M gomme o e boloke ka 4 °C. Ka letšatši la kalafo, hlatswa tharollo ye ka 1 M PPA go 3 mM le 5 mM PPA ka gare ga sedirišwa sa go hloka serum (DMEM/F-12 ka L-glutamine). Ditekanyetšo tša kalafo bakeng sa diteko ka moka di be di se na PPA (0 mM, taolo), 3 mM, le 5 mM PPA. Diteko di ile tša dirwa bonyenyane ka diphetolelo tše tharo tša thutaphedi.
Disele tša SH-SY5Y di ile tša bjalwa ka gare ga diflask tša 25 cm5 ka seelo sa 5.5 × 105 disele/ml gomme tša bjalwa diiri tše 24. Kalafo ya PPA e ile ya tlaleletšwa ka gare ga flask pele ga 24 h ya go duša. Kgoboketša dipellets tša sele ka go latela diprothokhole tša setšo sa ka fasana sa dinama tša diamusi tše di tlwaelegilego (tše di hlalošitšwego ka mo godimo). Emiša gape pellet ya sele ka gare ga 100 μl 2.5% glutaraldehyde, 1 × PBS gomme o e boloke ka 4 °C go fihlela e šongwa. Disele tša SH-SY5Y di ile tša centrifuged ka boripana go pellet disele le go tloša 2.5% ya glutaraldehyde, 1 × PBS tharollo. Emiša gape sedimente ka gare ga gel ya agarose ya 4% ye e lokišitšwego ka meetseng a distilled (tekanyo ya agarose go bophagamo bja sedimente ke 1:1). Dikarolwana tša agarose di ile tša bewa godimo ga digridi ka dipoleiteng tše di bataletšego gomme tša tlotšwa ka 1-hexadecene pele ga go gatsetša ka kgatelelo ya godimo. Disampole di ile tša gatsetšwa ka gare ga 100% ya acetone ye e omilego ka -90°C ka diiri tše 24. Ka morago themperetšha e ile ya hlatlošetšwa go -80°C gomme tharollo ya 1% ya osmium tetroxide le 0.1% ya glutaraldehyde e ile ya tlaleletšwa. Disampole di ile tša bolokwa ka -80°C ka diiri tše 24. Ka morago ga se, themperetšha e ile ya oketšega ganyenyane-ganyenyane go fihla go themperetšha ya phapoši ka matšatši a mmalwa: go tloga go – 80 °C go ya go – 50 °C ka diiri tše 24, go ya go – 30 °C ka diiri tše 24, go ya go – 10 °C ka diiri tše 24 gomme mafelelong go ya go themperetšha ya phapoši. themphereitšha.
Ka morago ga go lokišetša cryogenic, disampole di ile tša impregnated ka resin gomme dikarolo tša ultrathin (∼100 nm) di ile tša dirwa ka go šomiša Leica Reichert UltracutS ultramicrotome (Leica Microsystems). Dikarolo di be di šilafaditšwe ka 2% ya uranyl acetate le lead citrate. Disampole di ile tša bonwa ka go šomiša maekerosekopo ya elektrone ya phetišetšo ya FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (yeo pele e bego e le FEI), Eindhoven, The Netherlands) yeo e šomago ka 200 kV (fetiši ya Lab6) le khamera ya Gatan CCD (Gatan, UK) yeo e nago le sefa ya maatla ya Tridiem.
Ka phetolelo e nngwe le e nngwe ya setegeniki, bonyenyane diswantšho tše 24 tša sele e tee di ile tša hwetšwa, bakeng sa palomoka ya diswantšho tše 266. Diswantšho ka moka di ile tša sekaseka ka go šomiša makro ya Selete sa Kgahlego (ROI) le makro ya Mitochondria. Makro ya mitochondrial e theilwe godimo ga mekgwa ye e phatlaladitšwego17,31,32 gomme e dumelela tshepedišo ya sehlopha sa go itiriša ya diswantšho tša TEM ka Fiji/ImageJ69. Ka boripana: seswantšho se fetotšwe le go fetošwa ka go šomiša go tloša ga morago ga kgwele ya go kgokologa (radius ya dipiksele tše 60) le filtara ya bandpass ya FFT (go šomiša mellwane ya godimo le ya ka fase ya dipiksele tše 60 le 8 ka go latelelana) le go gatelela mola wa go ema ka kgotlelelo ya go sekamela ya 5%. Setšoantšo se sebelisitsoeng se ka tsela e iketsang thresholded sebelisa palo e kahodimodimo entropy algorithm le maske binary e generated. Dilete tša diswantšho tšeo di amanago le di-ROI tšeo di kgethilwego ka seatla diswantšhong tše tala tša TEM di ile tša ntšhwa, di hlaola mitochondria le go kgapeletša ntle lera la plasma le dilete tše dingwe tša phapano e kgolo. Bakeng sa ROI ye nngwe le ye nngwe ye e ntšhitšwego, dikarolwana tša binary tše kgolo go feta dipiksele tše 600 di ile tša sekaseka, gomme lefelo la dikarolwana, pherimitha, dilepe tše kgolo le tše nnyane, bophara bja Feret, go dikologa, le go ba sediko di ile tša lekantšhwa ka go šomiša mešomo ya go ela yeo e agetšwego ka gare ya Fiji/ImageJ. Latela Merrill, Flippo, le Strack (2017), sebakeng 2, dikarolwana lehlakore karo-karolelano (e khōlō ho e nyenyane sele karo-karolelano), le sebopeho ntlha (FF) ba ile ba balwa ho tloha ya data tsena, moo FF = pherimitha 2 / 4pi x sebaka. Tlhaloso ya fomula ya parametric e ka hwetšwa go Merrill, Flippo, le Strack (2017). Dimakro tše di boletšwego di hwetšagala go GitHub (bona Setatamente sa go hwetšagala ga Datha). Ka karolelano, dikarolwana tše ka bago 5,600 di ile tša sekaseka ka kalafo ya PPA, bakeng sa palomoka ya dikarolwana tše ka bago 17,000 (data ga se ya bontšhwa).
Disele tša SH-SH5Y di ile tša bewa ka gare ga dijana tša setšo tša diphapoši tše 8 (ThermoFisher, #155411) go dumelela go kgomarela bošego ka moka gomme ka morago tša bjalwa ka TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) le Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024 ). go taya. Diswantšho di ile tša hwetšwa ka go šomiša di-laser tša 405 nm le 561 nm ka tikologo ya 10 min, gomme diswantšho tše tala di ile tša hwetšwa bjalo ka z-stacks tšeo di nago le di-micrograph tše 10 tša seswantšho ka kgato ya az ya 0.2 μm magareng ga diforeime tša diswantšho ka dintlha tše 12 tša nako tše di latelago . Diswantšho di kgobokeditšwe ka go šomiša sefala sa tharollo ya godimo ya Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Jeremane) ka go šomiša lense ya LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Diswantšho di ile tša sekaseka ka go ImageJ ka go šomiša phaephe yeo e hlalošitšwego peleng le plugin ya ImageJ go ela ditiragalo tša go kopanywa le tša go arogana, palogare ya palo ya dibopego tša mitochondrial, le palogare ya bophagamo bja mitochondrial ka sele33. Dimakro tša MEL di hwetšagala go GitHub (bona Setatamente sa go hwetšagala ga Datha).
Disele tša SH-SY5Y di ile tša bjalwa ka dipoleiteng tša didiba tše tshela ka segokanyipalo sa 0.3 × 106 disele/mL ka diiri tše 24 pele ga kalafo. RNA e ile ya ntšhwa ka go šomiša protocol ya Quick-RNATM Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) ka diphetogo tše nnyane: oketša 300 μl ya RNA lysis buffer go sediba se sengwe le se sengwe pele ga go tlošwa le go lyse sampole ye nngwe le ye nngwe bjalo ka kgato ya mafelelo ka 30 μl ya DNase/RNase elution. -metsi a mahala. Disampole ka moka di ile tša hlahlobja ka bontši le boleng ka go šomiša NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer. Palomoka ya proteine ​​go tšwa go di-lysate tša sele e hweditšwe ka go šomiša 200 μl ya RIPA lysis buffer, gomme mahloriso a proteine ​​a ile a balwa ka go šomiša Bradford protein assay70.
Go tswakwa ga cDNA go dirilwe ka go šomiša TetroTM cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) go ya ka ditaelo tša motšweletši ka diphetogo tše dingwe. cDNA e ile ya hlangwa ka dikarabelo tša 20-μl ka go šomiša 0.7 go ya go 1 μg ya palomoka ya RNA. Di-primer di ile tša kgethwa go tšwa dipampiring tšeo di phatlaladitšwego peleng 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Table S1) gomme di-probe tše di sepelago le yona di hlamilwe ka go diriša sedirišwa sa PrimerQuest go tšwa go Integrated DNA Technologies. Dipshio ka moka tša kgahlego di ile tša tlwaelega go lephelo la nuclear B2M. Polelo ya dikarolwana tša leabela tša STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC le OPA1 e ile ya lekantšhwa ka RT-qPCR. Motswako wa mong o be o akaretša LUNA Taq polymerase (M3003L, New England Biolabs), 10 μM ya di-primer tša pele le tša morago, cDNA, le meetse a maemo a PCR go tšweletša bophagamo bja mafelelo bja 10 μL bakeng sa karabelo ye nngwe le ye nngwe. Polelo ya dikarolwana le dikarolwana tša leabela tša karogano (DRP1, MFN1/2) e ile ya lekantšhwa ka go šomiša diteko tša TaqMan multiplex. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) e ile ya šomišwa go ya ka ditaelo tša motšweletši ka diphetogo tše nnyane. Motswako wa mong wa multiplex RT-qPCR o akaretša 1X LUNA Taq polymerase, 10 μM ya di-primer tša pele le tša morago, 10 μM probe, cDNA, le meetse a maemo a PCR, go feleletša ka bophagamo bja mafelelo bja 20 μL bakeng sa karabelo ye nngwe le ye nngwe. RT-qPCR e dirilwe ka go šomiša Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—nomoro ya tatelano: R0618110). Maemo a go sepela ka dipaesekele a bontšhitšwe go Lenaneo la S1. Disampole ka moka tša cDNA di ile tša godišwa ka makga a mararo gomme koba ya maemo e ile ya tšweletšwa ka go šomiša letoto la dilutions tša makga a lesome. Dilo tše di sa tlwaelegago ka disampole tše tharo tše di nago le go fapoga ga maemo a moedi wa modikologo (Ct) >0.5 di ile tša tlošwa go tšwa tshekatshekong go netefatša gore datha e tšweletšwa gape30,72. Polelo ya dikarolwana tša leabela tša go lekana e ile ya balwa ka go šomiša mokgwa wa 2-ΔΔCt79.
Disampole tša proteine ​​(60 μg) di ile tša hlakantšhwa le Laemmli loading buffer ka tekanyo ya 2:1 gomme di sepetšwa ka 12% ya gel ya proteine ​​ye e se nago mmala (Bio-Rad #1610184). Diproteine ​​di ile tša fetišetšwa go lera la PVDF (polyvinylidene fluoride) (#170-84156, Bio-Rad) ka go šomiša tshepedišo ya Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Lera le ile la thibelwa gomme la bjalwa ka dithibela-maikwelo tša mathomo tša maleba (OPA1, MFN1, MFN2, le DRP1) (tše di hlapolotšwego ka 1:1000) ka diiri tše 48, gomme tša latelwa ke go dušwa ka dithibela-maikwelo tša bobedi (1:10,000) ka iri e tee. Ka morago ga moo dimembrane di ile tša tšewa diswantšho ka go šomiša Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) gomme tša rekotwa ka go šomiša tshepedišo ya Bio-Rad ChemiDoc MP. ImageLab phetolelo 6.1 e ile ya šomišwa bakeng sa tshekatsheko ya Western blot. Gel ya mathomo le blot di bontšhitšwe mo Seswantšhong sa S1. Tshedimošo ya dithibela-maikwelo e filwe go Lenaneo la S2.
Disete tša datha di tšweletšwa bjalo ka phošo ya magareng le ya maemo ya magareng (SEM) ya bonyane disampole tše tharo tše di ikemetšego. Disete tša datha di ile tša lekwa bakeng sa go tlwaelega ka go šomiša teko ya Shapiro-Wilks (ntle le ge go boletšwe ka tsela ye nngwe) pele go tšea kabo ya Gaussian le dikgelogo tša maemo tše di lekanago le go tšwela pele ka ditshekatsheko. Go tlaleletša go sekaseka sete ya data ka go diriša Fisher’s MEL LSD (p <0.05), tsela e tee ANOVA (kalafo vs. taolo bolela), le Dunnett’s multiple papiso teko go bona bohlokwa (p <0.05). Ditekanyetšo tša bohlokwa tša p di bontšhitšwe ka kerafong bjalo ka * p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****p <0.0001. Ditshekatsheko ka moka tša dipalopalo le dikerafo di dirilwe le go tšweletšwa ka go šomiša GraphPad Prism 9.4.0.
Dimakro tša Fiji/ImageJ tša tshekatsheko ya diswantšho tša TEM di hwetšagala phatlalatša go GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makro ya Mitochondrial Event Locator (MEL) e hwetšagala phatlalatša go GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM le Vijaya A. Mitochondria: balaodi ba maemo a godimo ba metabolism, homeostasis, kgateletšego, botšofadi le epigenetics. Se-Indonesia. Saense ya tša Kalafo ya Diphedi. J. 13 , 221-241 (2021) e le .
Ben-Shachar, D. Multifaceted mitochondrial dysfunction ka schizophrenia, rarahaneng I e le sepheo se khoneha sa pathological. Bolwetši bja go fetofetoga ga monagano. mohlodi. 187, 3-10 (2017) e le nngwe.
Bose, A. le Beal, MF Go se šome gabotse ga mitochondrial bolwetšing bja Parkinson. J. Dikhemikhale tša Methapo. 139, 216-231 (2016).
Sharma VK, Singh TG le Mehta V. Mitochondria e gateletšegilego: diphetho tša tlhaselo bolwetšing bja Alzheimer. Mitochondria 59 , 48-57 (2021) e le 'na.
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF le Ferreira GK Mitochondria le bjoko: bioenergetics le tše dingwe. Di-Neurotoxins tša ditšhika. mohlodi. 36, 219-238 (2019) e le nngwe.
Rangaraju, V. le ba bangwe. Pleiotropic mitochondria: khuetšo ya mitochondria go tšwelopele ya di-neuron le bolwetši. J. Thutamahlale ya Methapo. 39, 8200-8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. le Morais, V. A. Biogenesis ya mitochondrial ka di-neuron: bjang le kae. boditšhabatšhaba. J. M o h r . saense ya mahlale. 22, 13059 (2021) ya go swana le yona.
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. le Zhao, J. Taolo ya mafolofolo a mitochondrial ya diamusi: menyetla le ditlhohlo. ka pele. endocrine ya endocrine. (Lausanne) 11, 374 (2020) e lego ya go swana le yona.
Khacho, M. le Slack, RS Mitochondrial mafolofolo ka taolo ya neurogenesis: ho tloha ntshetsa pele ho ntshetsa pele boko ba batho ba baholo. tlhabollo. mafolofolo. 247, 47-53 (2018) e le nngwe.