Go hlopha diproteine ​​tseleng ya sephiri go bohlokwa bakeng sa go boloka go arolwa ga disele le homeostasis. Go tlaleletša go go hlopha mo go tsenywago gare ke dikgapetla, tema yeo e kgathwago ke di-lipid go hlopha ka kinesin mo tshepedišong ya go sepetša sephiri ke potšišo ya motheo yeo e lego kgale e le gona yeo e sego ya hlwa e arabja. Mona, re phetha 3D ka nako e le nngwe multicolor phahameng-qeto ea sebele nako litšoantšo ho paka ka vivo hore sa tsoa synthesized glycosylphosphatidylinositol-immobilized liprotheine le nako e telele haholo ceramide lipid moieties ba clustered le classified ka endoplasms khethehileng Net tsoa sebaka, e leng e fapaneng le hore sebediswa ke transmembrane diprotheine. Go tlaleletša, re bontšha gore botelele bja ketane ya ceramide ka gare ga lera la reticulum ya endoplasmic bo bohlokwa kudu bakeng sa go kgetha mo ga go hlopha. Thuto ya rena e fa bohlatse bja mathomo bjo bo lebanyago bja ka gare ga vivo go hlopha merwalo ya proteine ​​yeo e theilwego godimo ga botelele bja ketane ya lipid ka mafelong a go kgetha a diromelwantle ka tseleng ya sephiri.
Diseleng tša eukaryotic, diprotheine tšeo di hlamilwego ka gare ga reticulum ya endoplasmic (ER) di a hlophišwa ka morago nakong ya go sepetšwa ka tsela ya sephiri bakeng sa go išwa lefelong la tšona le le swanetšego la disele (1). Go tlaleletša go go hlopha mo go tsenywago gare ke kobo, e be e le kgale go akanyetšwa gore di-lipid tše itšego di ka šoma gape e le dintlha tša go tšwa tše di kgethilwego ka go di kgoboketša ka gare ga didomene tše itšego tša lera tšeo diprotheine tše itšego (2-5). Le ge go le bjalo, go sa na le tlhaelelo ya bohlatse bjo bo lebanyago bja ka gare ga mmele go hlatsela mokgwa wo wo o kgonegago wo o theilwego godimo ga lipid. Gore re kgone go rarolla bothata bjo bja motheo, re ithutile ka gare ga tomoso ka fao diproteine ​​tša glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored (GPI-APs) di romelwa ntle ka go fapana go tšwa go ER. GPI-APs ke mefuta e fapaneng ya lipid- amanang sele bokagodimo diprotheine ( 6, 7). GPI-AP ke proteine ​​ye e fihlilwego yeo e kgomareditšwego go matlakala a ka ntle a lera la plasma ka karolo ya glycolipid (GPI anchor). Ba amogela ditshetledi tša GPI bjalo ka diphetogo tša ka morago ga phetolelo tše di bolokago ka gare ga lumen ya ER (8). Ka morago ga kgomaretšo, GPI-AP e feta ka sedirišwa sa Golgi (5, 9) go tšwa go ER go ya go lera la plasma. Go ba gona ga ditshetledi tša GPI go dira gore GPI-AP e sepetšwe ka thoko go tšwa go diprotheine tše di ntšhwago ka transmembrane (go akaretšwa diprotheine tše dingwe tša lera la plasma) go bapa le tsela ya sephiri ( 5 , 9 , 10 ). Ka diseleng tša tomoso, GPI-APs di arogantšwe le diprotheine tše dingwe tše di fihlilwego ka gare ga reticulum ya endoplasmic, gomme ka morago tša phuthelwa ka gare ga divesike tša moswananoši tšeo di phuthetšwego ke kobo ya proteine ​​complex II (COPII) ( 6 , 7 ). Diphetho tša tshepedišo ye ya go hlopha tshepedišong ya diromelwantle tša ER ga di hlake, eupša go akanyetšwa gore mokgwa wo o ka nyaka di-lipid, kudu-kudu go bopša gape ga sebopego sa karolo ya lipid ya ankora ya GPI ( 5 , 8 ). Ka tomoso, GPI lipid remodeling qala hang-hang ka mor'a hore GPI khomaretse, 'me maemong a mangata, e etsa hore ceramide ho tlama ho 26-khapone telele-ketane saturated mafura acid (C26:0) (11, 12). C26 ceramide ke ceramide ye kgolo yeo e tšweleditšwego ke disele tša tomoso go fihla ga bjale. E hlamilwe ka ER gomme bontši bja yona e romelwa ntle go sedirišwa sa Golgi ka di-vesicles tša COPII (13). The ER thomelontle ya GPI-AP ka ho toba hloka tsoelang pele ceramide tswakana (14, 15), 'me ka lehlakoreng le leng, phetolo ya ceramide ho inositol phosphate ceramide (IPC) ka sesebediswa Golgi itšetlehile ka GPI ankora tswakana (16). Dinyakišišo tša biophysical ka lera la maitirelo di bontšhitše gore di-ceramide tša ketane ya acyl ye telele kudu di ka kopana go bopa didomene tše di laetšwego ka dithoto tša mmele tše di kgethegilego ( 17 , 18 ). Datha ye e lebiša go kgopolo ya gore C26 ceramide le GPI-AP ka C26 ceramide di šomiša dithoto tša tšona tša mmele go kopana go ba dilete tše di rulagantšwego goba dilete tikologong ya lipid ya lera la ER yeo e hlakahlakanego kudu. E bopilwe kudu ka di-glycerolipid tše kopana le tše di sa kgotsofatšwago (C16:1 le C18:1) (19, 20). Dilete tše di tla tsepelela ka go kgetha mafelong a itšego a go tšwa ER (ERES), moo GPI-AP yeo e theilwego godimo ga ceramide le ceramide di ka išwago mmogo go ya go Golgi ka gare ga vesicle ye e swanago ye e ineetšego ya COPII (5).
Thutong ena, re lekile ka ho toba mochine ona lipid-thehiloeng ka ho sebelisa super-qeto confocal nako ea sebele ho nka litšoantšo microscopy (SCLIM), e leng seha-bohale microscopy thekeniki ya hore ka nako e le nngwe hlokomela fluorescently labeled diprotheine The mebala e meraro le mahlakoreng a mararo (3D) litšoantšo na le qeto e phahameng haholo le lebelo ka lisele tse phelang (21, 22).
Re ile ra thoma ka go diriša theknolotši ya SCLIM go hlaloša gape ka fao GPI-AP ye e tlwaelegilego ka sehlopha sa ceramide sa C26 e ilego ya hlahlobja go tšwa go diproteine ​​tše di ntšhwago ka transmembrane ka morago ga go tlogela ER ka go S. cerevisiae. E le hore ho hlahloba classification ya ER, re ile ra sebelisa tsamaiso ea liphatsa tsa lefutso hore ka ka ho toba bona ka leihlo la kgopolo merwalo e sa tsoa synthesized kena ERES ka vivo ( 7 , 23 ). Bjalo ka thoto, re ile ra khetha C26 ceramide-thehiloeng GPI-AP Gas1 tšoauoa le tala fluorescent protheine (GFP) le transmembrane secreted protheine Mid2 tšoauoa le haufi-infrared fluorescent protheine (iRFP), tseo bobeli ba nepisa lera la plasma (24-26). Ka sec31-1 themperetšha-hlokolosi mutant, merwalo ye mebedi e bontšhwa ka fase ga galactose-inducible motšweletši le constitutive ERES leswao. Ka themperetšha ye e feteletšego (37 ° C), ka lebaka la gore phetogo ya diphedi ya sec31-1 e ama mošomo wa karolo ya kobo ya COPII Sec31 go thibela go mela ga COPII le thomelontle ya ER, merwalo ye e sa tšwago go hlangwa e kgoboketšwa ka ER (23). Ka morago ga go tonya go fihla themperetšheng ya fase (24°C), disele tša sec31-1 tša phetogophetogo di ile tša fola go tšwa lefelong la sephiri, gomme merwalo ye mefsa ya maitirelo ye e kgobokeditšwego e ile ya thoma go romelwa ntle go tšwa go ER. CLIM pono e bontšhitše gore bontši bja Gas1-GFP le Mid2-iRFP tšeo di sa tšwago go hlangwa di sa kgoboketšwa ka gare ga ER ya disele tša sec31-1 mutant ka morago ga go dušwa ka 37 ° C gomme ka morago tša lokollwa ka 24 ° C ka metsotso ye 5 ( Seswantšho 1 ). Ka ge Mid2-iRFP e phatlalatšwa godimo ga lera ka moka la ER, gomme Gas1-GFP e tsepame le go kgoboketšwa lefelong la lera la ER leo le sa tšwelago pele, kabo ya bona e fapane ka mo go feletšego ( Seswantšho 1, A go ya go C le Movie S1). Go tlaleletša, bjalo ka ge go bontšhitšwe go Seswantšho 1D, sehlopha sa Gas1-GFP ga se na Mid2-iRFP. Dipoelo tše di laetša gore GPI-AP le diproteine ​​tša transmembrane di ile tša arolwa ka dilete tše di fapanego tša ER membrane ka pela. Sehlopha sa Gas1-GFP se bapile le ERES ye e itšego yeo e ngwadilwego ka protheine ya kobo ya mCherry ya COPII Sec13 (Setshwantšho 1, E le F, le filimi ya S1) (23).
sec31-1 disele bontša galactose-hlohleletsago diphiri, e telele acyl ketane (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, tala) le transmembrane protheine Mid2-iRFP (TMP, putsoa) le ena Constructive ERES labeling Sec13-mCherry (ERES, magenta) ile incubated ka 37 ° C ka metsotso e 30, fallela ho 24°C, gomme e tšerwe seswantšho ke SCLIM metsotso ye 5 ka morago. (A go ya go C) e bontšha moemedi yo a kopantšwego goba seswantšho se tee sa 2D sa sefofane (A), seswantšho sa projeke sa 2D sa dikarolo tše 10 tša z (B) goba seswantšho sa hemisphere ya sele ya 3D sa merwalo le maswao a ERES (C). Sekala bareng 1μm (A le B). Yuniti ya tekanyo ke 0.551μm (C). Gas1-GFP e ile ya lemogwa ka dileteng tša ER tše di aroganego goba dihlopha, mola Mid2-iRFP e ile ya lemogwa le go phatlalatšwa go ralala le lera la ER (C). (D) Kerafo e bontšha maatla a fluorescence a go lekana a Gas1-GFP le Mid2-iRFP ka gare ga sehlopha sa Gas1-GFP go bapa le mola wa motsu wo mošweu (ka go le letshadi). AU, yuniti ya boithatelo. (E le F) emela seswantšho sa 3D seo se kopanyago dithoto le leswao la ERES. Dihlopha tša Gas1-GFP di ile tša lemogwa kgauswi le ERES ye e itšego. The sekala unit trust ke 0.551μm. (F) Motsu wo mošweu wo o tiilego o swaya sehlopha sa Gas1-GFP seo se amanago le ERES. Diphanele tša bogareng le tša go ja di bontšha seswantšho sa 3D seo se godišitšwego seo se kopantšwego le pono ye e dikološitšwego ya sehlopha sa Gas1-GFP seo se kgethilwego.
Kamano ya kgauswi ya sebaka magareng ga sehlopha sa Gas1-GFP le ERES ye e itšego e laetša gore Gas1-GFP e ka tsena ka gare ga ERES ye e kgethilwego, yeo e fapanego le go kgetha mo go šomišwago ke Mid2-iRFP go tlogela ER. Go rarolla kgonagalo ye, re ile ra lekanyetša tekanyo ya ERES bakeng sa thepa e tee goba tše pedi feela (Setshwantšho 2, A go ya go C). Re hweditše gore bontši bja ERES (70%) e na le mohuta o tee fela wa merwalo. Seswantšho sa ka fase sa Seswantšho 2C se bontšha mehlala ye mebedi ye e tlwaelegilego ya ERES ka Gas1-GFP fela (Figure 1) goba Mid2-iRFP fela (Figure 2). Ka go fapana, mo e ka bago 20% ya ERES e na le merwalo ye mebedi yeo e lekelelanago lefelong le tee. Go hweditšwe gore di-ERES tše dingwe (10%) di be di na le mehuta ye mebedi ya merwalo, eupša di be di arotšwe mafelong ao a fapanego ka mo go kwagalago. Ka fao, tshekatsheko ye ya dipalopalo e bontšha gore ka morago ga ge ER e rometšwe ntle, GPI-AP Gas1-GFP le merwalo ya transmembrane Mid2-iRFP di arotšwe ka ERES ye e fapanego (Setshwantšho 2D). Bokgoni bjo bja go hlopha bo sepelelana kudu le tshekatsheko ya peleng ya dikhemikhale tša diphedi (6) le boikemišetšo bja sebopego (7). Re ka lebelela gape boitshwaro bja merwalo yeo e beilwego ka thoko yeo e tsenago ERES (Setshwantšho 2E le Movie S2). Seswantšho 2E se bontšha gore ke karolo ye nnyane fela ya Gas1-GFP (phanele 3) goba Mid2-iRFP (phanele 4) yeo e tsenago ka gare ga ERES go tšwa ka lehlakoreng le tee gomme e tswaletšwe lefelong le le aroganego. Panele 5 ya Seswantšho 2E e bontšha gore Gas1-GFP le Mid2-iRFP ka dinako tše dingwe di hwetšwa ka go ERES ye e swanago, eupša di tsena go tšwa mahlakoreng a go fapana gomme di tsepame ka dileteng tše di aroganego tšeo di ka emelago divesike tša COPII tše di fapanego. Re ile ra boela ra netefatsa hore karohano hlokometse le classification ya C26 ceramide-thehiloeng GPI-AP Gas1 e le khetha ERES ke itseng hobane e mong transmembrane secretion thoto, e GFP-tagged plasma lera protheine Axl2 (27 ), bontša boitšoaro bo tšoanang le Mid2-iRFP. (Setšoantšo S1 le Movie S3). Axl2-GFP yeo e sa tšwago go hlangwa e phatlalatšwa ka lera la ER go swana le Mid2-iRFP (Figure S1, A le B), gomme e co-localized le Mid2-iRFP ka bontši bja ERES (Figure S1, B go ya go D). Diphanele 1 le 2 tša Seswantšho 1. S1C e bontšha mehlala ye mebedi ye e tlwaelegilego ya ERES moo merwalo ye mebedi ya transmembrane e kopanago. Maemong a, dithoto ka bobedi di tsena ERES mmogo (Setshwantšho S1E, Panele 3 le Movie S3).
The sec31-1 lisele tse bontša galactose inducible secretions, Gas1-GFP (GPI-AP, tala) le Mid2-iRFP (TMP, putsoa) le constitutive ERES labeling Sec13-mCherry (ERES, magenta) ba ile ba beha ka 37 Ka mor'a ho dusa metsotso e 30 ka °C, fallela ho 24 ° C ho lokolla secretion block, le setšoantšo le SCLIM ka mor'a Metsotso e 20. (A ho C) Moemedi 2D projeke litšoantšo (A; tekanyo bareng, 1μm) kapa 3D sele hemisphere litšoantšo (B le C; tekanyo unit trust, 0.456μm) ya thoto le 10 z-dikarolo tšoauoa ke ERES. Phanele ya ka fase go (B) le phanele ka go (C) di bontšha diswantšho tše di šomišitšwego go bontšha fela dithoto tšeo di lego gona ka go ERES (magenta) [Gas1-GFP (bohlokwa) le Mid2-iRFP (botala bja leratadima bjo bo bofefo)]. (C) Motsu o bulegilego: ERES e rwala feela seripa se tee sa merwalo (1 go ya go 4). Motsu o mohlooho: ERES e na le merwalo e arotšwego (5). Motsu o tiilego o mošweu: ERES yeo e nago le merwalo yeo e lego mmogo. Ka tlase: ERES e le nngwe e kgethilwego e na le feela Gas1-GFP (1) goba Mid2-iRFP (2). Sekala bareng, 100 nm. (D) Boleng bja photomicrograph yeo e hlalošitšwego go (C). Palogare ya phesente ya ERES yeo e nago le morwalo o tee fela (Gas1-GFP goba Mid2-iRFP), merwalo ye e arotšwego le merwalo ye e lekeletšego. Ka diteko tše tharo tše di ikemetšego, n = 432 ka diseleng tše 54. Phošo bareng = SD. Teko ya t ye e sa kopanywago ya mesela ye mebedi. *** P = 0.0002. (E) Seswantšho sa 3D sa ERES ye e kgethilwego ya merwalo ye e beilwego ka thoko yeo e swailwego ka (C). Gas1-GFP (botala) (3) goba Mid2-iRFP (botalalerata) (4) e tsena ka ERES (magenta) go tšwa ka lehlakoreng le tee gomme e lekanyeditšwe lefelong le lenyenyane ka gare ga ERES. Ka dinako tše dingwe, mehuta ye ka bobedi ya merwalo e tsena ka ERES e swanago (5) go tšwa ka lehlakoreng le tee gomme e tswaletšwe lefelong leo le lego lekatana ka gare ga ERES. Sekala bareng, 100 nm.
Se se latelago, re ile ra leka kgopolo ya gore ceramide ya ketane ye telele ya acyl (C26) yeo e lego gona ka gare ga lera la ER e otlela go kgoboketšwa mo go itšego le go hlopha ga Gas1 go ba ERES ye e kgethilwego. Go fihlelela se, re ile ra diriša mohuta wa tomoso wo o fetotšwego GhLag1, woo go wona di-synthase tše pedi tša ceramide tša ka gare Lag1 le Lac1 di ilego tša tšeelwa legato ke GhLag1 (homolog ya Lag1 ya kgapetla), go feleletša ka mohuta wa tomoso yeo e nago le mohuta wa lera la sele Ceramide wo mo kopana go feta mohuta wa hlaga ( Seswantšho 3A ) ( 28 ). Tshekatsheko ya spectrometry ya boima (MS) e bontšhitše gore ka mehuta ya mohuta wa hlaga, 95% ya palomoka ya ceramide ke ceramide ya ketane ye telele kudu (C26), mola ka GhLag1, 85% ya ceramide e le ye telele kudu (C18 le C16). ), ke feela 2% ya ceramide ke nako e telele haholo (C26) ketane ceramide. Le ge e le gore di-ceramide tša C18 le C16 ke di-ceramide tše kgolo tšeo di lemogilwego ka gare ga lera la GhLag1 go fihla ga bjale, tshekatsheko ya MS e tiišeditše gape gore ankora ya GPI ya Gas1-GFP yeo e bontšhitšwego ka gare ga mohuta wa GhLag1 e na le ceramide ya C26, yeo e bapetšwago le dilipid tša mohuta wa hlaga. Boleng bo a swana (Fig. 3A) (26). Ka fao, se se ra gore ensaeme ya go bopa leswa ya ceramide Cwh43 e kgetha kudu go C26 ceramide, bjalo ka ge go bontšhitšwe go Seswantšho 26, e akaretša ka kgetho ankora ya GPI go tšwa go palo ye nnyane ya C26 ceramide ka gare ga mohuta wa GhLag1. S2 (29) (29). Le ge go le bjalo, lera la sele la GhLag1 ge e le gabotse le na le C18-C16 ceramide fela, mola Gas1-GFP e sa na le C26 ceramide. Taba ye e dira gore kgatelelo ye e be sedirišwa se se loketšego sa go rarolla ka go lebanya bothata bja botelele bja ketane ya acyl ya ceramide ya lera ka ER. Karolo ya boikgopolelo ya sehlopha le go hlopha. Ka nako eo, re ile ra qala ka ho ithuta bokgoni ba C26 Gas1-GFP ho bokella ka dihlopha ka GhLag1 le mocheso-kutloisisoa mutant allele ya sec31-1 ka tloaelehileng fluorescence microscopy, moo feela telele (C18-C16) ketane teng ka ER lera Ceramide (Fig. 3). Re lemogile gore ka sec31-1, bontši bja Gas1-GFP bo be bo tsepame ka dihlopha, mola Gas1-GFP ka sec31-1 GhLag1 ka lera la ER la ceramide ye telele (C18-C16) ye telele kudu e be e sa kgobokane le go phatlalatšwa ka Ka gare ga lera ka moka la ER. Go ba ye e nepagetšego, ka lebaka la gore C26 ceramide-based clustering e amana kudu le ERES ye e itšego (Setshwantšho 1), re ile ra nyakišiša ka morago ge e ba tshepedišo ye e ka akaretša gape le mošomo wa mokgwa wa proteine ​​ya thomelontle ya ER. GPI-AP e sebelisa tsamaiso e khethehileng COPII bakeng sa ER thomelontle, e leng ka mafolofolo laolwa ke Ted1 ′s sebopeho remodeling ya karolo glycan ya GPI ankora ( 30 , 31 ). The recombinant GPI-glycan e ka nako eo lemohuoa ke transmembrane thoto receptor p24 rarahaneng, e leng ka lehlakoreng le leng kgethile thwala Lst1, e leng isoform itseng ea kgolo COPII thoto tlama subunit Sec24, theha e GPI-AP-ruileng COPII Vesicles ba hlokahala (31-33). Ka hona, re ile ra haha ​​habeli mutant hore kopanya hlakolwa ya diprotheine tsena tse le 'ngoe (the p24 rarahaneng karolo Emp24, GPI-glycan remodeling enzyme Ted1 le itseng COPII subunit Lst1) le sec31-1 mutant mofuta, 'me ithutile bona Na ho a khoneha ho bopa Gas1-sehlopha GFP (Figure 3). Re hlokometse hore ka sec31-1emp24Δ le sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP haholo-holo unclustered le aba ho pholletsa le ER lera, joalokaha pele ho bone ka sec31-1 GhLag1, ha ka sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Jwalo ka sec31-1. Dipoelo tše di laetša gore go tlaleletša go go ba gona ga C26 ceramide ka gare ga lera la ER, go kgoboketšwa ga Gas1-GFP gape go swanetše go tlama go p24 complex, gomme ga go nyake go thwala ga Lst1 ye e itšego. Ka morago ga moo, re ile ra hlahloba kgonagalo ya gore botelele bja ketane ya ceramide ka gare ga lera la ER bo ka laola go tlama ga Gas1-GFP go p24. Le ge go le bjalo, re hweditše gore go ba gona ga C18-C16 ceramide ka gare ga lera ga go ame di-GPI-glycan tšeo di agilwego lefsa ke p24 complex (Ditshwantšho S3 le S4, A le B) goba go tlama go GPI-AP le go romela ntle GPI-AP. bokgoni. Thwala COPII mofuta o monyenyane Lst1 (Setšoantšo S4C). Ka fao, C26 ceramide-dependent clustering ga e nyake ditirišano tša proteine ​​le mekgwa ye e fapanego ya proteine ​​ya thomelontle ya ER, eupša e thekga mokgwa wo mongwe wa go hlopha wo o sepedišwago ke botelele bja lipid. Ka morago ga moo, re ile ra sekaseka ge e ba botelele bja ketane ya ceramide acyl ka gare ga lera la ER bo bohlokwa bakeng sa go hlopha mo go šomago ga Gas1-GFP bjalo ka ERES ye e kgethilwego. Ka ge Gas1 ka gare ga mohuta wa GhLag1 ka ceramide ya ketane ye kopana e tlogela ER gomme e tsena ka gare ga lera la plasma (Setshwantšho S5), re dumela gore ge e ba go hlopha go sepedišwa ke botelele bja ketane ya acyl ya ceramide, Gas1 ka mohuteng wa GhLag1 e ka lebiša lefsa le go tshela. ERES thepa le lera le tšoanang.
(A) Lera la sele ya GhLag1 kudu-kudu le na le di-ceramide tše kopana tša C18-C16, mola ankora ya GPI ya Gas1-GFP e sa na le IPC ya C26 ye e swanago le disele tša mohuta wa hlaga. Ka godimo: tshekatsheko ya botelele bja ketane ya acyl ya ceramide ka gare ga lera la sele ya mehuta ya mohuta wa hlaga (Wt) le GhLag1p ka spectrometry ya boima (MS). ya data e emela phesente ya palo yohle ceramide. Palogare ya diteko tše tharo tše di ikemetšego. Phošo bareng = SD. Teko ya t ye e sa kopanywago ya mesela ye mebedi. **** P <0.0001. Bottom phanele: MS and analysis ya acyl ketane bolelele ba IPC teng ka Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI ankora bontšitsoeng ka hlaha-mofuta le GhLag1p mefuta e fapaneng. ya data e emela phesente ya palo yohle IPC pontšo. Palogare ya diteko tše hlano tše di ikemetšego. Phošo bareng = SD. Teko ya t ye e sa kopanywago ya mesela ye mebedi. ns, ga se bohlokwa. P = 0,9134. (B) Fluorescence micrographs ya sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ le sec31-1lst1Δ lisele tse bontša galactose-hlohleletsago Gas1-GFP ba ile ba incubated ka 37 ° C bakeng sa metsotso e 30 le fetisoa fatše ho Phetha kamehla fluorescence microscopy ka mor'a 24 ° C . Motsu o mošweu: sehlopha sa ER Gas1-GFP. Motsu o bulehileng: Unclustered Gas1-GFP e phatlalatšwa godimo ga lera ka moka la ER, e bontšha go tšhilafala ga lesale la nuclear la tšobotsi ya ER. Sekala bareng, 5μm. (C) Boleng bja photomicrograph yeo e hlalošitšwego go (B). Palogare ya phesente ya disele tšeo di nago le sebopego sa punctate Gas1-GFP. Ka diteko tše tharo tše di ikemetšego, n≥300 disele. Phošo bareng = SD. Teko ya t ye e sa kopanywago ya mesela ye mebedi. **** P <0.0001.
Go rarolla bothata bjo ka go lebanya, re ile ra dira SCLIM pono ya Gas1-GFP le Mid2-iRFP ka GhLag1 ka sec31-1 mocheso-kutloisiso mutant allele (Figure 4 le Movie S4). Ka morago ga gore ER e bolokwe ka 37°C gomme ka morago ya lokollwa ka 24°C, bontši bja Gas1-GFP yeo e sa tšwago go hlangwa ga se ya kgobokana le go phatlalatšwa go ralala le lera la ER, bjalo ka ge go lemogilwe ka dimaekrosekopo tše di tlwaelegilego (Setshwantšho 4, A le B ). Go tlaleletša, phesente ye kgolo ya ERES (67%) e akaretša mehuta ye mebedi ya merwalo yeo e lego mmogo ka go yona (Setshwantšho 4D). Diphanele 1 le 2 tša Seswantšho 4C di bontšha mehlala ye mebedi ye e tlwaelegilego ya ERES ka go lekelelana ga Gas1-GFP le Mid2-GFP. Go tlaleletša, dithoto ka bobedi di ile tša thwala ka gare ga ERES ye e swanago (Setshwantšho 4E, phanele 3 le filimi ya S4). Ka fao, dipoelo tša rena di laetša gore botelele bja ketane ya acyl ya ceramide ka gare ga lera la ER ke selo se bohlokwa seo se laolago go kgoboketšwa ga proteine ​​ya ER le go hlopha.
Disele tša Sec31-1 GhLag1 tšeo di bontšhago diphiri tše di hlotšwego ke galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, tala) le Mid2-iRFP (TMP, botalalerata) le Sec13-mCherry (ERES, magenta) yeo e swailwego ka ERES yeo e bopago Di duša ka 37°C. Tswela pele metsotso ye 30, theogela go 24°C go lokolla diphiri, gomme o tšee seswantšho ka SCLIM ka morago ga metsotso ye 20. (A go ya go C) Moemedi 2D projeke diswantšho (A; tekanyo bareng, 1μm) goba 3D sele hemisphere diswantšho (B le C; tekanyo unit trust, 0.45μm) ya 10 z-dikarolo tšoauoa ka thoto le ERES. Phanele ya ka fase go (B) le phanele ka go (C) di bontšha diswantšho tše di šomišitšwego go bontšha fela dithoto tšeo di lego gona ka go ERES (magenta) [Gas1-GFP (bohlokwa) le Mid2-iRFP (botala bja leratadima bjo bo bofefo)]. (C) Motsu wo o tletšego wo mošweu: ERES, dithoto di a swana. Bula motsu: ERES e na le ntho e le 'ngoe feela. Phanele ya ka fase: ERES ye e kgethilwego e na le dithoto tše di lekelelanago (1 le 2) tšeo di swailwego ka go (C). Sekala bareng, 100 nm. (D) Boleng bja photomicrograph yeo e hlalošitšwego go (C). Ka diyuniti tša sec31-1 le sec31-1 GhLag1, ke thoto e tee fela (Gas1-GFP goba Mid2-iRFP) yeo e akaretšwago, le palogare ya phesente ya ERES ya merwalo ye e arotšwego le merwalo ye e lekeletšego. Ka diteko tše tharo tše di ikemetšego, n = 432 ka diseleng tše 54 (sec31-1) le n = 430 ka diseleng tše 47 (sec31-1 GhLag1). Phošo bareng = SD. Teko ya t ye e sa kopanywago ya mesela ye mebedi. *** P = 0.0002 (sec31-1) le ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Seswantšho sa 3D sa ERES ye e kgethilwego ka merwalo ye e lekeletšego (3) yeo e swailwego ka go (C). Gas1-GFP (botala) le Mid2-iRFP (botalalerata) di batamela ERES (magenta) go tšwa ka lehlakoreng le tee gomme di dula lefelong le le swanago le le thibetšwego la ERES. Sekala bareng, 100 nm.
Thuto ye e fa bohlatse bjo bo lebanyago bja ka gare ga vivo bja gore merwalo ya proteine ​​ye e theilwego godimo ga lipid e arotšwe ka mafelo a diromelwantle a go kgetha ka tseleng ya sephiri, gomme e utolla bohlokwa bja botelele bja ketane ya acyl bakeng sa go kgetha ga go hlopha. Ka go diriša thekniki e matla le ya maemo a godimo ya microscopy yeo e bitšwago SCLIM, re bontšhitše Gas1-GFP yeo e sa tšwago go hlangwa (e lego lera le legolo la plasma GPI-AP yeo e nago le ketane e telele kudu ya acyl (C26) karolo ya lipid ya ceramide) ka gare ga tomoso ) Dilete tšeo di kgobokeditšwego ka gare ga di-ER tše di aroganego di tswalanywa le ERES e itšego, mola diprotheine tšeo di fihlilwego ka transmembrane di phatlalatšwa go ralala le lera la ER (Setshwantsho 1). Go tlaleletša, mehuta ye mebedi ya dithoto e tsena ka ERES ye e fapanego ka go kgetha (Setshwantšho 2). Bolelele bja ketane ya acyl ya ceramide ya sele ka gare ga lera bo fokotšegile go tšwa go C26 go ya go C18-C16, sehlopha sa Gas1-GFP se šitišwa ka seleteng sa ER se se aroganego, gomme Gas1-GFP e rerouted go tlogela ER ka protheine ya transmembrane ka ERES ye e swanago ( Seswantšho 3 le Seswantšho 3 ). 4).
Le ge GPI-AP e šomiša mokgwa wo o kgethegilego wa proteine ​​go tšwa ER, re hweditše gore karoganyo ye e ithekgilego ka C26 ceramide ga e ithekge ka ditirišano tša proteine ​​tša phapano tšeo di ka lebišago go go ikgetha ga ERES (Difego S4 le S5). Go e na le moo, dikhwetšo tša rena di thekga mokgwa wo mongwe wa go hlopha wo o sepedišwago ke go kgoboketšwa ga diproteine ​​tše di theilwego godimo ga lipid le go kgaphelwa ka ntle ga merwalo ye mengwe ka morago. Ditebelelô tša rena di bontšha gore selete sa Gas1-GFP goba sehlopha seo se amanago le ERES ye e itšego se hloka protheine yeo e ntšhwago ka transmembrane Mid2-iRFP, yeo e bontšhago gore sehlopha sa GPI-AP seo se ithekgilego ka C26 ceramide se tla nolofatša go tsena ga bona ka gare ga ERES ye e lebanego, gomme ka nako ye e swanago, se sa akaretše transmembrane Diphiri di tsena ka gare ga ERES ye e itšego (Difego 1 le 2). Ka go fapana, go ba gona ga di-ceramide tša C18-C16 ka gare ga lera la ER ga go dire gore GPI-AP e bope dilete goba dihlopha, ka fao ga di kgapele ntle goba go tšea legato la diproteine ​​tše di ntšhwago ka transmembrane go ERES ye e swanago (Ditshwantšho 3 le 4). . Ka fao, re šišinya gore C26 ceramide e otlela karoganyo le go hlopha ka go nolofatša go kgoboketšwa ga diproteine ​​tšeo di kgokagantšwego le ERES ye e itšego.
Tsela ya go fihlelela go kgobokana mo mo go ithekgilego ka ceramide ya C26 ka lefelong le le itšego la ER? Tshekamelo ya ceramide ya lera ya go arogana ka mahlakoreng e ka dira gore GPI-AP le C26 ceramide di bope dilipid tše nnyane le tše di laetšwego ka ponyo ya leihlo tikologong ya lipid ye e sa laolegego kudu ya lera la ER leo le nago le di-glycerolipid tše kopana le tše di sa kgotsofatšwago. Dihlopha tša boleng (17, 18). Dihlopha tše tše nnyane tša nakwana di ka kopanywa gape go ba dihlopha tše kgolo, tše di tsepamego ka morago ga go tlama go p24 complex ( 34 ). Go sepelelana le se, re bontšhitše gore C26 Gas1-GFP e swanetše go dirišana le p24 complex go bopa dihlopha tše kgolo tše di bonagalago ( Seswantšho 3 ). The p24 rarahaneng ke heterozygous oligomer bopilwe ka tse 'nè fapaneng p24 transmembrane diprotheine ka tomoso (35), e leng fana ka multivalent tlamang, e leng ka lebisa ho sefapano-kgokaganyo ya dihlopha tse nyenyane GPI-AP, ka tsela eo generating kgolo Stable sehlopha (34). Tšhomišano magareng ga diprotheine ectodomains ya GPI-APs e ka ba le seabe gape go aggregation ya bona, bjalo ka ge go bontšhitšwe nakong ya dinamelwa tša bona tša Golgi ka diseleng tša epithelial tša diamusi tše di polarized ( 36 ). Le ge go le bjalo, ge C18-C16 ceramide e le gona ka gare ga lera la ER, ge p24 complex e kgomarela Gas1-GFP, dihlopha tše kgolo tše di aroganego di ka se bopege. Mokgwa wa motheo o ka ithekga ka dithoto tše itšego tša mmele le tša dikhemikhale tša ceramide ya ketane ye telele ya acyl. Dinyakišišo tša biophysical tša membrane ya maitirelo di bontšha gore le ge e le gore bobedi di-ceramide tša ketane ya acyl tše telele (C24) le tše kopana (C18-C16) di ka hlola karoganyo ya kgato, ke fela di-ceramide tša ketane ya acyl ye telele (C24) tšeo di ka kgothaletšago go koba ga godimo ga Curvature le filimi go bopa filimi lefsa. Ka tšhupetšo ya bobedi (17, 37, 38). Go bontšhitšwe gore helix ya transmembrane ya TMED2, homologue ya motho ya Emp24, e dirišana ka go kgetha le sphingomyelin yeo e theilwego go C18 ceramide ka gare ga di-lobules tša cytoplasmic ( 39 ). Ka go diriša ditshepedišo tša go ekiša tša diphetogo tša dimolekule (MD), re hweditše gore bobedi di-ceramide tša C18 le C26 di kgoboketšwa go dikologa di-lobule tša cytoplasmic tša helix ya transmembrane ya Emp24, gomme di na le dikgetho tše di swanago ( Seswantšho S6 ). Go bohlokwa go lemoga gore se se laetša gore helix ya transmembrane ya Emp24 e ka lebiša go kabo ya asymmetric ya lipids ka gare ga lera. Ye ke sephetho sa morago bjale seo se theilwego diseleng tša diamusi. Dilo tše di swanago tša go ekiša tša MD le tšona di bontšha go ba gona ga di- lipid tša ether (40) . Ka fao, re fopholetša gore C26 ceramide ka gare ga di-lobule tše pedi tša ER26 e humišitšwe ka mo nageng. Ge GPI-AP ka gare ga di-lobules tša luminal e kgomarela ka go lebanya go p24 ya multivalent le go kgoboketšwa ga C26 ceramide go dikologa p24 ka gare ga di-lobules tša cytoplasmic, e ka kgothaletša go kgoboketšwa ga Proteine ​​mo go sepelago le yona le go kobega ga membrane di tšweletšwa ka menwana ( 41 ), e lego seo se dirago gore GPI-AP e arogane ka dilete tše di aroganego tšeo di bapilego le ERES, tšeo gape di ratago tšeo di kobegilego kudu dilete tša lera la ER ( 42 ). Dipego tša peleng di thekgile mokgwa wo o šišintšwego ( 43 , 44 ). The multivalent tlamang ya oligolectins, pathogens kapa lithibela-mafu ho ceramide-thehiloeng glycosphingolipids (GSL) ka lera la plasma di hlohleletsago kgolo GSL aggregation, ntlafatsa mohato karohano le baka lera deformation le internalization ( 44 ). Iwabuchi bj.bj.(43) Go hweditšwe gore ka go ba gona ga diketane tša acyl tše telele (C24) eupša e sego tše kopana (C16), ligand ya multivalent yeo e tlemilwego go GSL lactosylceramide e hlohleleditše go bopša ga dihlopha tše kgolo le go hlaselwa ga lera, gomme phetolelo ya leswao yeo e tsenywago gare ke cytoplasm Lyn godimo ga dipampišana e interdigitated ke diketane tša acyl ka go kopanywa di-neutrophil tša go swana le tša di-neutrophil.
Ka mammalian polarized epithelial lisele tse, mahloriso a-ba khahlanong le Golgi marangrang (TGN) ho boemo ba apical plasma lera laola karohano le hlophisa ha GPI-AP ( 10 , 45 ). Aggregation ena e khannoang ke GPI-AP oligomerization ( 36 ), empa e ka boela e itšetlehile ka ceramide ketane bolelele re fumana ka tomoso. Le ge e le gore GPI-AP ya diamusi e na le ankora yeo e theilwego godimo ga lipid ya ether, gomme sebopego sa yona sa dikhemikhale se fapane kudu le ceramide ya ketane ya acyl ye telele kudu, nyakišišo ya morago bjale e hweditše gore dilipid ka bobedi di na le dithoto tša mmele le tša dikhemikhale tše di swanago ka tlhagelelo Le mošomo ( 40 ). Ka fao, karolo ya lipid ya ether ka diseleng tša diamusi e ka swana le ceramide ya C26 ka gare ga tomoso, gomme tema ya yona ke go amana le ceramide ya ketane ye telele ka gare ga lera go tšwetša pele go kgoboketšwa le go hlopha ga GPI-AP. Le ge e le gore kgonagalo ye e sa swanetše go lekwa thwii, dikhwetšo tša peleng di thekga gore go sepetšwa ga ceramide ya ketane ye telele ya acyl go ya mmeleng wa Golgi ga go dirwe ke diproteine ​​tša phetišetšo ya cytoplasmic, eupša go ithekgile ka tswako ya ditshetledi tša GPI go swana le tomoso. Ka fao, mokgwa wa go boloka wa tlhagelelo o bonala o kgona go kgetha go sepetša mmogo ceramide ya ketane ya acyl ye telele kudu le GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ka gare ga vesicle ye e swanago ya dinamelwa.
Ka ditshepedišong tša disele tša epithelial tšeo di arotšwego ka komelo le tša diamuši, go kgoboketšwa ga GPI-AP le go arogana le diprotheine tše dingwe tša lera la plasma ka moka di direga pele di fihla bokagodimo bja sele. Paladino le ba bangwe. . Bokagodimo bja sele. Ka tomoso, thuto ena e bontšitse hore C26 ceramide-itšetlehileng GPI-AP sehlopha ka ER ka laola sehlopha mokgatlo le mosebetsi mosebetsi oa GPI-AP ka lera la plasma ( 24 , 49 ). Go sepelelana le mohlala wo, disele tša GhLag1 di allergic go dithibela-maikwelo tša GPI goba diokobatši tšeo di amago botshepegi bja lebota la sele ( 28 ), gomme go nyakega ga dihlopha tše di šomago tša Gas1-GFP ( 49 ) tša ceramide ya ntlha yeo e akantšwego ka go nyalana ga disele tša tomoso go bontšha G Ditlamorago tša fisioloji tše di kgonegago tša disele tša hLag1. Phošo ya GPI-AP. Le ge go le bjalo, go dira diteko tše dingwe ge e ba mokgatlo wa mošomo wa bokagodimo bja sele o rulagantšwe go tšwa go ER ka mokgwa wa go hlopha wo o theilwego botelele bja lipid e tla ba taba ya nyakišišo ya rena ya ka moso.
Mehuta ya Saccharomyces cerevisiae ye e šomišitšwego mošomong wo e lokeleditšwe go Lenaneo la S1. Mehuta ya MMY1583 le MMY1635 ya SCLIM ya go tšea diswantšho tša disele tše di phelago e agilwe ka morago ga W303. Mefuta ena bontša Sec13-mCherry le fluorescent protheine tag ba ile ba hahoa sebelisa polymerase ketane karabelo (PCR)-thehiloeng mokgwa wa le pFA6a plasmid e le thempleite ( 23 ). Mohuta wo o bontšhago Mid2-iRFP wo o swailwego ka proteine ​​ya fluorescent ka fase ga taolo ya motšweletši wa GAL1 o agilwe ka tsela ye e latelago. PCR go godišwa ga tatelano ya iRFP-KanMx go tšwa go pKTiRFP-KAN vector (mpho ya E. O'Shea, Addgene plasmid nomoro 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; sešupo sa mohlodi wa nyakišišo (RRID): Addgene_64687) Gomme e tsentšwe ka gare ga C-terminus ya endogenous Mid2. Ka morago ga ge tatelano ya genome ya Mid2-iRFP e godišitšwe le go cloned ka gare ga motšweletši wa GAL1, e ile ya kopanywa ka gare ga lefelo la Not I-Sac I la plasmid ya kopanyo pRS306. Plasmid yeo e tšweletšego pRGS7 e ile ya linearized le Pst I go kopanya ka gare ga lefelo la URA3.
Lephelo la go kopanywa la Gas1-GFP le bontšhwa ka fase ga taolo ya motšweletši wa GAL1 ka gare ga plasmid ya centromere (CEN), yeo e agilwego ka tsela ye e latelago. Tatelano ya Gas1-GFP e ile ya godišwa ka PCR go tšwa go plasmid ya pRS416-GAS1-GFP (24) (mpho ya L. Popolo) gomme ya tšweletšwa ka gare ga lefelo la Xma I–Xho I la plasmid ya CEN pBEVY-GL LEU2 (mpho ya C) . Miller; Addgene plasmid nomoro ya 51225; http://n2t.net/addgene: 51225, e le nngwe ya ditlhaloso. RRID: Addgene_51225) ya go swana le yona. Plasmid yeo e tšweletšego e ile ya rewa leina la pRGS6. Lephelo la go kopanywa la Axl2-GFP le lona le bontšhwa ka fase ga taolo ya motšweletši wa GAL1 wa vector ya pBEVY-GL LEU2, gomme kago ya yona ke ka tsela ye e latelago. Tatelano ya Axl2-GFP e ile ya godišwa go tšwa go pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plasmid (23) ka PCR, gomme ya cloned ka gare ga lefelo la Bam HI-Pst I la vector ya pBEVY-GL LEU2. Plasmid yeo e tšweletšego e ile ya rewa leina la pRGS12. Tatelano ya di-oligonucleotide tšeo di šomišitšwego mo nyakišišong ye e lokeleditšwe go Lenaneo la S2.
Mohuta o ile wa tlaleletšwa ka 0.2% ya adenine le 2% ya glucose [YP-dextrose (YPD)], 2% ya raffinose [YP-raffinose] ye e humilego ya tomoso setsopolwa proteine ​​p (YP) magareng (1 % Tomoso setsopolwa le 2% proteine ​​ept). (YPR)] or 2% galactose [YP-galactose (YPG)] as a carbon source, or in a synthetic minimal medium (0.15% yeast nitrogen base and 0.5% ammonium sulfate) to supplement appropriate amino acids and bases required for nutrition , And containing 2% glucose (synthetic glucose minimal medium) or 2% galactose (maiketsetso galactose bonyane mahareng) e le mohloli khabone.
Bakeng sa go tšea diswantšho ka nako ya nnete, disele tša sec31-1 tšeo di nago le kwelobohloko ya themperetšha tšeo di bontšhago sebopego ka fase ga motšweletši wa GAL1 di ile tša bjalwa ka gare ga YPR ka gare ka 24°C bošego ka moka go ya go kgato ya bogareng bja log. Ka morago ga induction ka YPG ka 24°C ka iri ye 1, disele di ile tša bjalwa ka gare ga SG ka 37°C ka metsotso ye 30, gomme ka morago tša fetišetšwa go 24°C go lokollwa go tšwa go secretion block. Concanavalin A e ile ya šomišwa go lokiša disele godimo ga selaete sa galase gomme ya tšewa seswantšho ka SCLIM. SCLIM ke motswako wa Olympus IX-71 inverted fluorescence maekerosekopo le UPlanSApo 100 × 1.4 dipalo aperture oli lense (Olympus), lebelo le phahameng le phahameng-pontšo-ho-lerata karo-karolelano dikologela disk confocal skena (Yokogawa Electric), tloaelo spectrometer, le tloaelo tsidifatso The tsamaiso ea setšoantšo intensifier (Hamamatsu Photonics) e ka fana ka tshepedišo ya lense ya go godiša ka go godiša ga mafelelo ga × 266.7 le khamera ya sedirišwa yeo e kopantšwego le tefo yeo e atišago dielektherone (Hamamatsu Photonics) (21). Setšoantšo fumana e phethwa ke tloaelo software (Yokogawa Electric). Bakeng sa diswantšho tša 3D, re ile ra diriša sedirišwa sa piezoelectric seo se dirilwego ka mokgwa wa go ikgetha go thothomela lense ya maikemišetšo ka go otlologa, gomme ra kgoboketša dikarolo tša optical ka thoko ga 100 nm ka gare ga mokgobo. Seswantšho sa Z-stack se fetošetšwa go ya data ya voxel ya 3D, gomme mošomo wa go phatlalatša ntlha ya teori wo o šomišwago bakeng sa maekerosekopo ya confocal ya disk yeo e dikološago o šomišwa go tshepedišo ya deconvolution ka software ya Volocity (PerkinElmer). Ka go šomiša softwere ya Volocity go threshold ka go itiriša ya tshekatsheko ya lefelo la go kopana, ERES go akaretšwa merwalo e ile ya lekantšhwa. Tshekatsheko ya skena sa mola e dirilwe ka go šomiša softwere ya MetaMorph (Molecular Devices).
Šomiša softwere ya GraphPad Prism go bona bohlokwa bja dipalopalo. Bakeng sa teko ya t ya Student ya mesela ye mebedi le teko ye e tlwaelegilego ya tshekatsheko ya tsela e tee ya phapano (ANOVA), diphapano magareng ga dihlopha di tšewa e le tšeo di nago le khuetšo ye kgolo go P <0.05 (*).
Bakeng sa microscopy ya fluorescence ya Gas1-GFP, disele tša kgato ya log di ile tša godišwa bošego ka moka ka YPD gomme tša kgoboketšwa ka centrifugation, tša hlatswiwa gabedi ka phosphate buffered saline, gomme tša bjalwa godimo ga leqhoa bonyane metsotso ye 15, gomme ka morago tša tšwela pele ka fase ga maekerosekopo bjalo ka ge go hlalošitšwe peleng Check (24). Maekerosekopo ya Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oli PH3 CS) yeo e nago le lense ya maikemišetšo, sefa ya L5 (GFP), khamera ya Hamamatsu le softwere ya Application Suite X (LAS X) e ile ya šomišwa go hwetša. .
Disampole di ile tša denatured ka SDS sampole buffer ka 65 ° C ka metsotso ye 10, gomme ka morago tša arolwa ka SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Bakeng sa tshekatsheko ya immunoblotting, 10 μl ya sampole e ile ya imelwa ka mothaladi. Antibody ya mathomo: Šomiša anti-Gas1 ya polyclonal ya mmutla ka go hlatswa ga 1:3000, anti-Emp24 ya polyclonal ya mmutla ka go hlatswa ga 1:500, le anti-GFP ya polyclonal ya mmutla (mpho go tšwa go H. Riezman) ka go hlatswa ga 1:3000. Sebolaya-ditwatši sa monoclonal sa toeba sa anti-Pgk1 se ile sa šomišwa ka go hlatswa ga 1:5000 (mpho go tšwa go J. de la Cruz). Antibody ya bobedi: Horseradish peroxidase (HRP) conjugated pudi anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) ye e šomišwago ka go hlatswa ga 1:3000 (Pierce). HRP-conjugated pudi anti-mouse IgG e ile ya šomišwa ka dilution ya 1:3000 (Pierce). Lefelo la karabelo ya boitshireletšo bja mmele le ile la bonwa ka mokgwa wa chemiluminescence wa SuperSignal West Pico reagent (Thermo Fisher Scientific).
Bjalo ka ge go hlalositšwe go (31), teko ya tlhago ya immunoprecipitation e dirilwe ka karolwana ya ER yeo e humišitšwego. Ka boripana, hlatswa disele tša tomoso ka TNE buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride le motswako wa thibela protease) ka 600 nm ( OD600) ka 100 segokanyipalo sa optical gabedi. E ile ya robega ka dipheta tša galase, gomme ka morago ditlakala tša sele le dipheta tša galase di ile tša tlošwa ka go centrifugation. Ka morago ga fao supernatant e ile ya centrifuged ka 17,000 g ka metsotso ye 15 ka 4°C. Pellet e ile ya emišwa gape ka gare ga TNE gomme digitalis saponin e ile ya tlaleletšwa go fihla go mahloriso a mafelelo a 1%. Go emišwa go ile gwa bjalwa iri ye 1 ka go dikološa ka 4°C, gomme ka morago dikarolo tše di sa qhibidigego di ile tša tlošwa ka go centrifugation ka 13,000 g ka 4°C ka metsotso ye 60. Bakeng sa Gas1-GFP immunoprecipitation, pele dudiša sampole ka dipheta tša agarose tše di se nago selo (ChromoTek) ka 4°C ka iri ye 1, gomme ka morago o duše ka GFP-Trap_A (ChromoTek) ka 4°C ka diiri tše 3. Dipheta tša immunoprecipitated di ile tša hlatswiwa ka makga a mahlano ka TNE yeo e nago le 0.2% ya digoxigenin, tša hlatswiwa ka buffer ya sampole ya SDS, tša arolwa go SDS-PAGE, gomme tša sekaseka ka immunoblotting.
Bjalo ka ge go hlalošitšwe go (31), boikemišetšo bja go kgokaganya sefapano bo ile bja dirwa ka karolwana ya ER yeo e humišitšwego. Ka boripana, karolwana ya ER ye e humišitšwego e ile ya bjalwa ka 0.5 mM dithiobis (succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20 ° C, 20 min). Karabelo ya crosslinking e ile ya tingwa ka go tlaleletša ka glycine (50 mM mahloriso a mafelelo, metsotso ye 5, 20°C).
Bjalo ka ge go hlalošitšwe peleng (50), tshekatsheko ya MS ya ceramide ka mehuta ya mohuta wa hlaga le ya GhLag1 e dirilwe. Ka boripana, disele di ile tša bjalwa go fihla go kgato ya go bontšha (3 go ya go 4 diyuniti tša OD600/ml) ka gare ga YPD ka 30°C, gomme disele tša 25×107 di ile tša bunwa. Metabolism ya bona e tingwa ka esiti ya trichloroacetic. Diriša solvent ya go ntšha [ethanol, meetse, ether, pyridine le 4.2 N ammonium hydroxide (15:15:5:1:0.018 v/v)] le 1.2 nmol ya boleng bja ka gare bja maemo a C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid). Diriša monomethylamine reagent [methanol, meetse, n-butanol le tharollo ya methylamine (4:3:1:5 v/v)] go dira hydrolysis ya alkaline ye bonolo ya setsopolwa, gomme ka morago o šomiše n-butanol ye e kgotsofetšego ka meetse go tloša letswai. Mafelelong, setsopolwa se ile sa emišwa gape ka gare ga solvent ya mokgwa wo mobotse [chloroform/methanol/meetse (2:7:1) + 5 mM ammonium acetate] gomme sa hlabja ka gare ga spectrometer ya boima. Go hlokomela dikarabelo tše ntši (MRM) go dirilwe bakeng sa go hlaola le go lekanyetša dimolekule tša sphingolipid. The TSQ Vantage tertiary quadrupole boima spectrometer (Thermo Fisher Scientific) e hlomelloa le roboto nanoflow ion mohloli Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) bakeng sa and analysis lipid. Matla a thulano a optimized bakeng sa sehlopha se seng le se seng sa ceramide. ya data MS ile fumanwa ka mokgwa wa molemo. Bakeng sa phetolelo e nngwe le e nngwe ya thutaphedi, leswao la lipid ke magareng a dikelo tše tharo tše di ikemetšego.
Bjalo ka ge go hlalošitšwe go (31), disele (800 × 107) tšeo di bontšhago Gas1-GFP di ile tša dirwa ka fase ga immunoprecipitation ya tlhago. Gas1-GFP ye e hlwekišitšwego e ile ya arolwa ka SDS-PAGE gomme ya fetišetšwa go lera la polyvinylidene fluoride (PVDF). Proteine ​​e ile ya bonwa ka leihlo la kgopolo ka go tšhilafatša PVDF ka amide black. Sehlopha sa Gas1-GFP se ile sa segwa go tšwa go PVDF gomme sa hlatswiwa ka makga a 5 ka methanol le gatee ka meetse a mphato wa chromatography ya seela-MS (LC-MS). Ka go duša lera hlobolisa le 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), buffer le 500μl sa tsoa hlapolotsoeng 1 M sodium nitrite motsoako ka 37 ° C bakeng sa lihora tse 3, karolwana lipid e lokolloa ho tloha Gas1-GFP le lysed Tokollo ea inosine phosphate ceramide pakeng tsa glucosamine le inositol (51). Ka morago ga moo, lešela la lera le ile la hlatswiwa ka makga a mane ka meetse a mphato wa LC-MS, la omišwa ka themperetšheng ya phapoši, gomme la bolokwa ka lefaufaung la naetrotšene ka -80°C go fihlela go hlahlobja. Bjalo ka taolo, sampole ye e se nago selo ya lera la PVDF e ile ya šomišwa bakeng sa teko ye nngwe le ye nngwe. Lipid yeo e ntšhitšwego go tšwa go Gas1-GFP e ile ya hlahlobja ka morago ke MS bjalo ka ge go hlalositšwe ( 50 ). Ka boripana, dithipa tša PVDF tšeo di nago le GPI-lipid di ile tša emišwa gape ka gare ga 75μl ya solvent ya hlobo ye mpe [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium acetate] gomme tša fetiša electrospray ionization (ESI)-MRM/MS Analysis ya mehuta ya sphingolipid (TSQ Vantage). Tabeng ye, ya data ya MS e ile ya hwetšwa ka mokgwa wa ion ye mpe.
Bjalo ka ge go boletšwe pejana, karolo ya lipid ya ankora ya GPI e ile ya arolwa go tšwa go GPI-AP yeo e swailwego ka [3H]-inositol ( 16 ). Dilipid di ile tša arolwa ka chromatography ya legato le le sesane ka go šomiša tshepedišo ya solvent (55:45:10 chloroform-methanol-0.25% KCl) gomme tša bonwa ka leihlo la kgopolo ka go šomiša FLA-7000 (Fujifilm).
Disele tšeo di bontšhago Gas1-GFP (600×107) di ile tša hlatswiwa gabedi ka TNE buffer ka TNE buffer, gomme tša robega ka dipheta tša khalase, gomme ka morago tša centrifuged go tloša ditlakala tša sele le dipheta tša khalase. Ka morago ga fao supernatant e ile ya centrifuged ka 17,000 g ka iri ye 1 ka 4°C. Pellet e ile ya hlatswiwa ka gare ga TNE gomme ya bjalwa ka 1 U PI-PLC (Invitrogen) ka gare ga TNE yeo e nago le 0.2% digitalis saponin ka iri ye 1 ka 37°C. Ka morago ga kalafo ya ensaeme, lera le ile la tlošwa ka go centrifugation ka 17,000 g ka 4°C ka iri ye 1. Go immunoprecipitate Gas1-GFP, supernatant e ile ya bjalwa ka GFP-Trap_A (ChromoTek) ka 4°C bošego ka moka. Gas1-GFP ye e hlwekišitšwego yeo e arotšwego ka SDS-PAGE e ile ya šilafatšwa ka Coomassie brilliant blue. Sehlopha sa go tšhilafala sa Gas1-GFP se ile sa kgaolwa go tšwa go bohlokwa bjo bo dikologilego mokero wa meetse, gomme ka morago ka morago ga alkylation ka iodoacetamide le phokotšo ka dithiothreitol, tšhilo ya dijo ka gare ga gel ka trypsin e ile ya dirwa. Ntšha le go omiša dipeptide tša tryptic le dipeptide tše di nago le GPI-glycans. Peptide ye e omilego e ile ya hlapološwa ka gare ga 20 μl ya meetse. Ente karolo (8μl) ka LC. Kholomo ya octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; bophara bja ka gare 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japane) e ile ya šomišwa go aroganya dipeptide ka fase ga maemo a itšego a gradient. Mogato wa sellathekeng ke solvent A (0.08% ya esiti ya formic) le solvent B (0.15% ya esiti ya formic ka gare ga 80% ya acetonitrile). Tshepedišo ya Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) e ile ya šomišwa go hlatswa kholomo ka solvent A ka gare ga metsotso ye 55 ka seelo sa go ela sa 50 μl min-1 ka metsotso ye 5, gomme ka morago ga moo mahloriso a solvent B a ile a oketšega go fihla go 40%. , United States). Eluate e ile ya tsenywa ka go tšwela pele ka gare ga mothopo wa ion wa ESI, gomme dipeptide tša tryptic le dipeptide tšeo di nago le GPI-glycans di ile tša hlahlobja ka LTQ Orbitrap XL (motswako wa linear ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific). Ka peakanyo ya MS, gagamalo ya mohlodi wa capillary e ile ya bewa go 4.5 kV, gomme themperetšha ya capillary ya phetišetšo e ile ya bolokwa go 300°C. Gagamalo ya capillary le gagamalo ya lense ya tube di be di beilwe go 15 V le 50 V, ka go latelelana. MS ya data e ile ya hwetšwa ka mokgwa wa ion ye botse (tharollo ya 60,000; go nepagala ga boima bja dikarolo tše 10 ka milione) ka boima bja go fapana bja 300/m/z boima/tefiso karo-karolelano (m/z) 3000. Ya data ya MS/MS e hwetšwa ka sefero sa ion ka gare ga LTQ Orbitrap XL [dinomoro tše 3 tša mathomo tšeo ya data e ithekgilego ka tšona, thulano e hlohleleditšwego ke go arogana (CID)].
MD simulations ba ile ba phethwa sebelisa GROMACS (52) software le MARTINI 2 matla tšimo (53-55). Ka morago ga fao Seagi sa Lera la CHARMM GUI (56, 57) se ile sa šomišwa go aga bilayer yeo e nago le dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) le Cer C18 goba DOPC le Cer C26. Topology le dihlomathišo tša Cer C26 di tšwa go DXCE ka go tloša dipheta tše di oketšegilego go tšwa moseleng wa sphingosine. Šomiša tshepedišo ye e hlalošitšwego ka mo tlase go lekalekanya legato la go ba gabedi le go le sepetša, ke moka o šomiše dihlomathišo tša mafelelo tša tshepedišo go aga tshepedišo yeo e nago le Emp24. Domain ya transmembrane ya tomoso Emp24 (mašaledi a 173 go ya go 193) e ile ya agwa bjalo ka α-helix ka go šomiša sebopego sa dimolekule sa sedirišwa sa pono sa MD (VMD) ( 58 ). Ka morago ga moo, ka morago ga go tloša di-lipid tšeo di lekelelanago, proteine ​​e ile ya tšhelwa ka makgwakgwa gomme ya tsenywa ka gare ga bilayer ka go diriša CHARMM GUI. Tshepedišo ya mafelelo e na le 1202 DOPC le 302 Cer C26 goba 1197 DOPC le 295 Cer C18 le Emp24. Ionize tsamaiso ho mahloriso ya 0.150M. Diphetolelo tše nne tše di ikemetšego di dirilwe bakeng sa ditlhamo tše pedi tša bilayer.
The lipid bilayer e leka-lekana ka ho sebelisa CHARMM GUI tshebetso, e leng akarelletsa ho fokotsa ebe leka-lekanya mehato e 405,000, moo lithibelo boemo ba butle-butle fokotswa le ho felisa, 'me mohato nako e eketseha ho tloha 0.005 ps ho 0.02 ps. Ka morago ga tekatekano, e tšweletša 6 μs ka kgato ya nako ya 0.02 ps. Ka morago ga go tsenya Emp24, šomiša tshepedišo ye e swanago ya CHARMM GUI go fokotša le go lekalekanya tshepedišo, gomme o kitime ka 8 s ka tšweletšong.
Bakeng sa ditshepedišo ka moka, nakong ya tshepedišo ya go lekalekanya, kgatelelo e laolwa ke barostat ya Berendsen (59), gomme nakong ya tshepedišo ya tšweletšo, kgatelelo e laolwa ke barostat ya Parrinello-Rahman (60). Maemong ka moka, kgatelelo ya magareng ke 1 bar gomme go šomišwa sekema sa go kopanya kgatelelo ya seka-isotropic. Ka tshepedišo ya tekatekano le tšweletšo, thermostat (61) yeo e nago le go lekanya gape ka lebelo e šomišwa go kopanya themperetšha ya dikarolwana tša proteine, lipid le solvent ka go latelelana. Nakong ya tshebetso yohle, thempereichara sepheo ke 310K. Tšhomišano yeo e sego ya kgokagano e balwa ka go tšweletša lenaneo la go kopanya ka go šomiša sekema sa Verlet ka kgotlelelo ya buffer ya 0.005. Polelo ya Coulomb e balwa ka go šomiša tšhemo ya karabelo le sekgala sa go kgaolwa sa 1.1 nm. Polelo ya Vander Waals e šomiša sekema sa go kgaola ka sekgala sa go kgaola sa 1.1 nm, gomme sekema sa go kgaola sa Verlet se šomišwa bakeng sa go kgeloga mo go ka bago gona (62).
Ka go šomiša VMD, maphoto a go kgaolwa magareng ga dipheta tša fosfate tša DOPC goba dipheta tša ceramide AM1 le proteine ​​ke 0.7 nm, gomme palo ya dilipid tšeo di dirišanago le proteine ​​e a balwa. Ho ea ka formula e latelang, bala depletion-enrichment (DE) factor e le ka (63): DE factor = (palo ea palo yohle lipids ka protheine 0.7) ka protheine 0.7 (palo ea Cer ka palo yohle lipids) .
Boleng bjo bo begilwego bo hwetšwa bjalo ka palogare, gomme dibara tša phošo ke dikopi tše nne tše di ikemetšego tša SE. Bohlokwa bja dipalopalo bja DE factor bo balwa ka teko ya t [(karolelanoDE-factor-1)/SE]. Bala boleng bja P go tšwa go kabo ya mosela o tee.
Sedirišwa sa GROMACS se ile sa šomišwa go bala mmapa wa 2D wa segokanyipalo sa ka mahlakoreng wa tshepedišo yeo e nago le Emp24 ka gare ga 250 ns ya mafelelo ya mohlala. Gore go hwetšwe mmapa wa go humiša/go fokotšega ga ceramide, mmapa wa segokanyipalo sa Cer o arotšwe ka palomoka ya mmapa wa Cer le DOPC, gomme ka morago wa arolwa ka go tsepama ga Cer mmeleng. Sekala se se swanago sa mmapa wa mmala se a šomišwa.
Bakeng sa didirišwa tša tlaleletšo tša sehlogo se, hle bona http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Ye ke sengwalwa sa phihlelelo ye e bulegilego seo se phatlalatšwago ka fase ga dipeelano tša Laesense ya Creative Commons Attribution-Non-Commercial, yeo e dumelelago tšhomišo, kabo le go tšweletša gape ka gare ga sedirišwa sefe goba sefe, ge fela tšhomišo ya mafelelo e se ya poelo ya kgwebo gomme motheo e le gore mošomo wa mathomo o nepagetše. Tšhupetšo.
Ela hloko: Re go kgopela fela gore o nee aterese ya gago ya imeile gore motho yo o mo kgothaletšago letlakaleng a tsebe gore o nyaka gore a bone imeile yeo le gore ga se spam. Re ka se thope diaterese tša imeile dife goba dife.
Potšišo ye e šomišwa go leka ge eba o moeti le go thibela go romela ga spam ka go itiriša.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D phahameng-qeto nako ea sebele litšoantšo senola bohlokoa ba ceramide ketane bolelele bakeng sa protheine hlopha ka khetha dipholo tsa libakeng tse.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D phahameng-qeto nako ea sebele litšoantšo senola bohlokoa ba ceramide ketane bolelele bakeng sa protheine hlopha ka khetha dipholo tsa libakeng tse.
©2020 Mokgatlo wa Amerika wa Tšwetšopele ya Saense. ditokelo tsohle di sireleditswe. AAAS ke molekane wa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef le COUNTER. Kgatelopele ya Mahlale ISSN 2375-2548.