Re leboga go etela Nature.com.Phetolelo ya sephephediši yeo o e šomišago e na le thekgo ye e lekanyeditšwego ya CSS.Bakeng sa maitemogelo a mabotse, re kgothaletša gore o šomiše sephephediši se se mpshafaditšwego (goba o time mokgwa wa go sepelelana go Internet Explorer).Mo nakong ye, go netefatša thekgo ye e tšwelago pele, re tla bontšha sebaka ntle le ditaele le JavaScript.
Go fapana le diphoofolo tša marapo a mokokotlo, dikhunkhwane di naganwa ka bophara gore di hloka dihomoune tša steroid tša thobalano tšeo di nago le leeme la banna.Ka go Anopheles gambiae, ecdysone steroid 20-hydroxyecdysone (20E) e bonala e hlabologile go laola kgolo ya mae ge e hlamilwe ke tše tshadi2 le go hlohleletša nako ya go se kgone go nyalana ge e fetišetšwa ka thobalano ke tše tona3.Go tloga ge kgolo ya mae le go nyalana ke dika tše bohlokwa tša pelego, go kwešiša ka moo menang ya tshadi ya Anopheles e kopanyago matshwao a a dihomoune go ka nolofatša tlhamo ya mananeo a mafsa a taolo ya malaria.Mo, re utolla gore mešomo ye ya pelego e laolwa ke disteroid tša thobalano tše di fapanego ka netweke ye e raraganego ya diensaeme tše di raraganego tša ecdysteroid-activating/inactivating.Re ile ra hlaola ecdysone ye e itšego ya oxidized, . 3-dehydro-20E (3D20E), yeo e šireletšago botswadi ka go tswalela go amogela thobalano ya basadi ka morago ga phetišetšo ya thobalano le go tsenywa tirišong ka dephosphorylation.Ka mo go lemogegago, phetišetšo ya 3D20E e hlohleleditše gape polelo ya dikarolwana tša leabela tša pelego tšeo di bolokago kgolo ya mae nakong ya tshwaetšo ya Plasmodium, go netefatša maphelo a ditshadi tše di fetetšwego.20E yeo e tšwago go basadi ga e hlohleletše thobalano karabelo, eupša e dumelela batho bao ba nyalanago go beela mae ka morago ga ge di-kinase tšeo di thibelago 20E di thibetšwe.Go hlaolwa ga homoune ye ya steroid ya dikhunkhwane ye e itšego ya banna le tema ya yona go laola go amogela thobalano ya basadi, pelego le tirišano le Plasmodium go šišinya bokgoni bja go fokotša katlego ya pelego ya menang yeo e fetišago malaria.
Ditiragalo tša malaria le mahu di a hlatloga gape4 ka lebaka la kganetšo ye e atilego ya dibolayadikhunkhwane ka go menang ya Anopheles, e lego yona e nnoši yeo e rwalago diphelakadingwe tša malaria tša batho.Thutaphedi ya go nyalana ya menang ye ke nepišo ye e kgahlišago kudu ya ditsenogare tša taolo ya malaria ya padi ka lebaka la gore tše tshadi di nyalana gatee fela5; go dira gore tiragalo ye e tee ya go nyalana e se be le malwetši go tla ba le bokgoni bjo bogolo bja go fokotša palo ya menang ka tšhemong.
Basadi ba palelwa ke thobalano ka morago ga go amogela dihomoune tša steroid tša titer ya godimo go tšwa go banna.Dinyakišišo di bontšhitše gore sešušumeletši sa bothata bja go nyalana gape ke 20-hydroxyecdysone (20E), e lego homoune ya steroid yeo e tsebjago kudu bjalo ka molaodi wa modikologo wa molting mo legatong la dibokwana.Bokgoni bja banna bja go kopanya le go fetišetša 20E bo tšweletše ka go lebanya ka Mehuta ya Anopheles yeo e lego karolo ya subgenus ya Cellia7, yeo e phatlalatšwago ka Afrika gomme e akaretša diphetetši tše kotsi kudu tša malaria, go akaretšwa Anopheles gambiae.Se se lemogwa kudu ka gobane mehuta ye ditshadi le tšona di tšweletša 20E ka morago ga dijo tše dingwe le tše dingwe tša madi, gomme 20E e otlela modikologo wa oogenesis (bona ref. 8).Le ge go le bjalo, ga go tsebje mo gontši ka tsela yeo ditshadi di kopanago ka yona ditšhupetšo go tšwa methopong ye mebedi ye e fapanego ya ecdysone (phetišetšo ya banna le go hlohleletša go fepa madi) ntle le go senya bokgoni bja bona bja go nyalana.Ge e le gabotse, ge 20E yeo e tšweleditšwego ke tše tshadi e hlohleletša go se kgotlelele thobalano, se se tla lebiša go go hloka thari go batho bao ba fepago kgarebe, e lego boitshwaro bjo bo tlwaelegilego kudu go menang ye5.
Tlhaloso ye e kgonegago ke gore tše tona tša A. gambiae di fetišetša ecdysone ye e fetotšwego ye e itšego ya tona, yeo e dirago gore cascade ya matshwao e šome ka gare ga pampišana ya pelego ya basadi, go feletša ka go se tsepame ga go nyalana.Le ge go le bjalo, le ge e le gore diphedi tša marapo a mokokotlo di na le dihomoune tše ntši tša steroid, go swana le estrogen le androgen (tšeo di hlahlobilwego go ref. 9), go ya ka tsebo ya rena, disteroids tše di sekamego ka androgenic ga se tša hlaolwa ka dikhunkhwane.
Re ile ra ikemišetša go bona repertoire ya dihomoune tša steroid ka gare ga tšhika ya tona ya go thuša (MAG) ya A. gambiae yeo e godilego ka thobalano go nyaka di-steroid tše di kgonegago tša go fetoša.Using chromatography ya seela ya tshepedišo ya godimo yeo e kopantšwego le tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) go e na le mokgwa wo o sa itšego kudu wo o šomišitšwego peleng, re ile ra utolla ecdysone (E) le 20E ka gare ga dinama tše, go tiišetša peleng result.Le ge go le bjalo, sampole e be e laolwa ke di-steroid tša phosphorylated tšeo di oxidized, tšeo di sepelelanago le formula ya 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (Setshwantšho 1).Dibopego tše dingwe di akaretša 3-dehydro-20E (3D20E) le 20E-22-phosphate (20E22P).The HPLC-MS/MS signality of 3D20E22P e be e le ditaelo tše pedi tša bogolo bjo bo phagamego go feta sebopego sa yona sa dephosphorylated, 3D20E, le ditaelo tše tharo tša bogolo bjo bo phagamego go feta bja E le 20E (Setshwantšho 1).Le ge e le gore dikarolong tše dingwe tša mmele le pampišana ya pelego ya ka fase (LRT; Extended Data Seswantšho. 1a).Re ile ra sekaseka gape di-ecdys ka banna bao ba sa tšwago go tswalelwa (<1 day old) le tše tshadi gomme di lemogilwe 3D20E le 3D20E22P fela ka go MAG; E, 20E le 20E22P di be di le gona ka bong ka bobedi (Extended Data Fig. 1b).Data ye e šišinya gore A. gambiae tše tona tše kgolo di tšweletša titers tše di phagamego tša dihomoune tša go fetoša ka gare ga di-MAG tša tšona tšeo di sa hlangwago ke tše tshadi.
MAG le LRT e tšehali (ho akarelletsa le atria, vesicles seminal, le parovarium) ba ile ba dissected ho tloha matsatsi a 4 (matsatsi a 4) kgarebe batona le kgarebe le mated females (0.5, 3, le 12 hpm).Ecdysone ka dinama tse nyenyane tse e ile sekaseka ka HPLC-MS / MS (bolela ± sem; unpaired t-test, mahlakoreng a mabeli, sekgahla sa kutollo ya maaka (FDR) se phošollotšwe, * P <0.05, ** P <0.01 . Diiri tše 3 vs. 0.5 diiri, P = 0.25; 20E, mmala wa namune; 20E22P, e pherese; 3D20E, e putsoa; 3D20E22P, pinki.The inset e oketša tekanyo godimo ga y-axis go bontšha maemo a tlase a ecdysone.
Go nyakišiša ge e ba 3D20E22P le 3D20E di fetišetšwa nakong ya go nyalana, re ile ra arola di-LRT tša basadi ka dintlha tša nako tše di fapanego ka morago ga go nyalana.Le ge e le gore ecdysone ga se ya hwetšwa go dikgarebe, re lemogile palo ye kgolo ya 3D20E22P ka go LRT gateetee ka morago ga go nyalana (0.5 h ka morago ga go nyalana, hpm), e fokotšega ge nako e dutše e eya, mola 3D20E maemo a eketsehile haholo (Fig. 1).Ka ho sebelisa lik'hemik'hale synthesized 3D20E e le tekanyetso, re ile ra ikemisetsa hore maemo a ena steroid hormone ka ho nyalana LRTs ne bonyane 100-makhetlo a phahameng ho feta 20E (Extended Data Table 1).Kahoo, 3D20E22P ke ecdysone e khōlō e tona e fetisetswa ho LRT e tšehali nakong ea ho nyalana, le sebopego sa yona sa dephosphorylated, 3D20E, e ba ye ntši kudu ka moragonyana ga go nyalana.Se se šišinya tema ye bohlokwa ya ecdysone ya morago ka go thutaphedi ya tshadi ya ka morago ga go nyalana.
Ka morago ga go tšweletša dataset ye mpsha ya tatelano ya RNA (RNA-seq) (Fig. 2a), re šomiša phaephe ya bioinformatics yeo e agilwego ka mokgwa wa go ikgetha, re ile ra nyaka ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), le ecdysone yeo e ngwalago khoutu ya 20E-fetošitšwego phosphatase gene.EPP) e bontšhwa ka gare ga tissues.We hlwaya lephelo le tee la nkgetheng la EPP le tše pedi bokgoni EcK liphatsa tsa lefutso (EcK1 le EcK2), empa ba ne ba sa khone ho fumana molemo nkgetheng EO gene.Notably, motho ka mong EPP liphatsa tsa lefutso ba ile ba bontšitsoe ka maemo a phahameng (98.9th percentile) ka Gambian MAGs empa eseng ka LRTs basali (Fig. 2b), ho fapana le ditebello tsa rona ho tloha dephosphorylation ea 3D20E22P e etsahetse ka ena tissue.Therefore, re lumela gore EPP e tona e ka fetišetšwa nakong ya go nyalana.Ka nnete, re šomišitše go swaya isotope ye e tsepamego ka vivo go bipa proteine ​​ya basadi ka morago ga go nyalana, e lego ensaeme yeo e hlaotšwego ke MS ka atrium ya basadi (Fig. 2c le Table Supplementary 1).Go ba gona ga EPP ka go MAG le go nyalana (eupša e sego kgarebe) ya tshadi LRT le yona e ile ya tiišetšwa ka go šomiša dithibela-maikwelo tše itšego (Fig. 2d).
a, Phaephe ya bioinformatics yeo e agilwego ka mokgwa wa go nyaka dithišu tša pelego tša bong bjo bongwe le bjo bongwe bakeng sa dikarolwana tša leabela tšeo di ngwalago di-EcK, di-EO, le di-EPP.Dinomoro tšeo di lego kgaufsi le mesebe di bontšha palo ya bonkgetheng ba banna le ba basadi mogatong o mongwe le o mongwe.Tshekatsheko ye e lemogile lephelo le tee la EPP (EPP) le lephelo le tee la EcK (EcK1) leo le bontšhwago go banna, le lephelo le tee la EcK (EcK2) yeo e bontšhwago ka bong ka bobedi eupša ga e tšweletše lephelo la nkgetheng la EO.b, Heatmap e bapetša polelo ya lephelo la nkgetheng ka gare ga kgarebe (V) le go nyalana (M) Anopheles gambiae le Anopheles albicans tissues.Spca, monontšha; MAGs, dikgeleswa tša tlaleletšo go banna; dikarolo tše dingwe tša mmele, go akaretšwa matswele, maphego, maoto, mebele ya makhura, le ditho tša ka gare bong ka bobedi, le mae a dikgogo go basadi.EcK2 e bontšhwa kudu ka bobedi MAG le atria ya Gambia, mola EPP e hwetšwa fela go MAG.c, Proteomic analysis of male ejaculate group translocation into female atria at 3, 12 and 24 hpm, e bontšhago diproteine ​​tše 67 tše ntši kudu.Ditshadi di ile tša godišwa ka dijo tše di nago le 15N go swaya (le go bipa) diproteine ​​ka moka.Ditona tše di sa swaiwago di ile tša nyalelanywa le tše tshadi tše di swailwego, gomme di-LRT tša basadi di ile tša arolwa ka 3, 12 le 24 hpm bakeng sa tshekatsheko ya proteomic (bona Lenaneo la Tlaleletšo 1 bakeng sa lenaneo le le feletšego la diproteine ​​tša go rota).Inset, EPP, Eck1 le EcK2 di ile tša lemogwa ka go MAG ya banna ba kgarebe ka tshekatsheko ya proteomic ya dinama tše.d, EPP e ile ya lemogwa ka western blot ka go MAG le LRT ya ditshadi tše di nyalanego, eupša e sego ka go ditshadi tša kgarebe goba tše tona goba mmele ka moka wa basadi.Membranes di ile tša nyakišišwa ka nako e tee ka anti-actin (taolo ya go rwala) le dithibela-maikwelo tša anti-EPP.All males are virgins.See Seswantšho sa tlaleletšo 1 bakeng sa data ya mohlodi wa gel.Western blots di dirilwe gabedi ka dipoelo tše di swanago.
Mošomo wa ecdysteroid phosphophosphatase wa EPP o ile wa netefatšwa ka morago ga go dušwa ka HPLC-MS/MS ka 3D20E22P yeo e arotšwego go tšwa go MAG (Extended Data Fig. 2a).Go feta moo, ge re khutšišitše EPP ka tšhitišo yeo e tsentšwego gare ke RNA (RNAi), re ile ra utolla phokotšo ye maatla ya mošomo wa phosphatase ka gare ga dinama tša go tswala tša banna ba (Fig. 3a), le basadi mated le EPP-khutsitsoeng males bontšitse bohlokoa Karolo e tlaase ea dephosphorylated 3D20E (Fig. 3b) ho sa tsotellehe karolo liphatsa tsa lefutso silencing (Extended Data Fig. 2b,c).Ka ho fapana, re sa lemoha liphetoho tse khōlō ka 20E22P / 20E karo-karolelano ka monang tšoanang, e leng ka 'na fana ka maikutlo a hore ensaeme e itseng bakeng sa 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Go fokotšega ga mošomo wa phosphatase ka go MAG wo o hlotšwego ke go homotša ga EPP ka go šomiša taolo ya EPP RNA ya ditlhale tše pedi (dsEPP) goba GFP RNA ya ditlhale tše pedi (dsGFP).Matamo a masomepedi a MAG a ile a šomišwa ka go phetošo ye nngwe le ye nngwe (P = 0.0046, teko ya t ye e kopantšwego, ya mahlakore a mabedi), yeo e emetšwego ke marontho a aroganego.b, Ditshadi tše di nyalanego le tše tona tše di khutšišitšwego ka EPP di be di na le a karolo e tlase haholo ya dephosphorylated 3D20E ka 3 hpm (P = 0.0043, unpaired t-teko, mahlakoreng a mabeli), athe 20E maemo a ne a sa ameha (P = 0.063, unpaired). t-test, two-sided).Data di tšweletšwa bjalo ka magareng ± sem go tšwa matamong a mararo a ditshadi tše 13, 16 le 19 e nngwe le e nngwe.c, Ditshadi tšeo di nyalanego le tše tona tše di homoditšwego ka EPP di be di na le ditekanyo tše di phagamego kudu tša go nyalana gape (P = 0.0002, teko ye e nepagetšego ya Fisher, ya mahlakore a mabedi).Ditshadi di ile tša gapeletšega pele go nyalana go netefatša maemo a tšona a go nyalana; Matšatši a 2 ka morago, ba ile ba ikgokaganya le banna ba bangwe bao ba rwelego peu ya transgenic go sekaseka ditekanyo tša go nyalana gape ka go utolla ga PCR ka boleng bja transgene.d, Ditshadi tše di fepilwego ka madi tšeo di nyalanego le tše tona tše di homoditšwego ka EPP di be di fokotšegile kudu pelego (P <0.0001; teko ya Mann-Whitney, ya mahlakore a mabedi) le palo ya mae yeo e fokotšegilego gannyane (P = 0.088, teko ya Mann-Whitney, ya mahlakore a mabedi) , mola seelo sa go tswala se be se sa amege (P = 0.94, teko ya Fisher ye e nepagetšego, ya mahlakore a mabedi).Ka diphaneleng ka moka, n e emela palo ya disampole tša menang tše di ikemetšego ka thutaphedi.NS, ga se ya bohlokwa.* P <0.05, ** P <0.01, ***P <0.001, ****P < 0.001 e le .
Se se latelago, re ile ra hlahloba ge e ba ecdysone dephosphorylation e bohlokwa bakeng sa go hlohleletša go ganetša go nyalana go tše tshadi.Ka mo go lemogegago, tše tshadi tšeo di nyalanago le tše tona tšeo di feletšwego ke EPP di ile tša nyalana gape ka maqhubu a godimo kudu (44.9%) go feta tše tshadi tša taolo (10.4%) ge di pepentšhwa go tše tona tša tlaleletšo (tše di fetotšwego dikarolwana tša leabela) (Fig. 3c).Re ile ra bona gape go fokotšega mo gogolo ga pelego (Fig... 3d, le letshadi) le go fokotšega go se nene ga palo ya mae ao a beilwego ke tše tshadi tše (Fig. 3d, bogareng), mola phesente ya mae a beetšwego ke tše tshadi (karabelo ye nngwe yeo e hlohleleditšwego go tše tshadi ka go nyalana )) ga se tša amega (Fig. 3d, go le letona).Given the observed specificity of EPP for 3D20E22P, these results suggest that the activation of 3D20E ka EPP yeo e fetišitšwego nakong ya go nyalana e ka ba le tema ye bohlokwa go tima go amogela ga basadi go nyalana gape, e lego boitshwaro bjo pele bo bego bo akaretša phetišetšo ya thobalano ya 20E .Ka fao, homoune ye ye e itšego ya banna le yona e ama kudu pelego ya basadi.
Se se latelago, re ile ra bapetša mediro ya 20E le 3D20E ka diteko tša go hlabela go dikgarebe tše di godilego ka thobalano re diriša 3D20E yeo e hlamilwego ka dikhemikhale (Fig. 4a–c) le 20E yeo e hwetšagalago ka kgwebo maemo a fisioloji a 3D20E ka LRT (1,066 pg ka morago ga ente vs. 2,022 pg ka morago ga go nyalana) a hlohleleditše karolo ya ditshadi tše di sa kgonego go lwantšha yeo e bego e le godimo ka makga a 20 go feta maemo a fisioloji a 20E (361 pg ka morago ga ente) diiri tše 24 ka morago ga go hlabja ka mahloriso a godimodimo 18 pg ka morago ga go nyalana; Lenaneo la Datha ye e Atološitšwego 1).Sephetho se se sepelelana le kgopolo ya gore phetišetšo ya thobalano ya 20E ga e hlole dinako tša go se kgone go nyalana, gomme go tšwela pele go šupa 3D20E bjalo ka selo se segolo go netefatša kamano ya motswadi le ngwana.3D20E e be e bile e le mafolofolo kudu go feta 20E ka ditekolong tša go beela mae go ditshadi tša kgarebe (Fig. 4e), e šišinya gore tekanyo ya go beela mae ye e tlwaelegilego re hlokometšwe ka morago ga go homotšwa ga karolo ya EPP e be e le ka lebaka la go ba gona ga mošomo wa mašaledi wa 3D20E wo o sa tšweleditšwego ke mabaka a basadi ao a hlohleleditšwego ke Mating.
(a,b) 3D20E e hlamilwe ka dikhemikhale go tšwa go 20E (a) ka phetošo/bokgoni bjo bo phagamego kudu (data yeo e tšweleditšwego bjalo ka magareng ± sem go tšwa go dikarabelo tše tharo tša tswako tše di ikemetšego) (b).c, Sepektheramo sa boima (halofo ya ka fase) e swana gabotse le ecdysone yeo e hwetšwago ka go LRT ya tshadi ye e nyalanego (halofo ya godimo).d, Ge e bapetšwa le 20E (0.63 μg, P = 0.02;0.21 μg, P <0.0001; (0.63 μg, P = 0.0002; 0.21 μg, P = 0.54; Teko ye e nepagetšego ya Fisher, 2-sided).e, ente ya 3D20E e hlohleleditše ditekanyo tše di phagamego kudu tša go tswala ka ditshadi tša kgarebe go feta 10% ya taolo ya ethanol (0.21 μg, P <0.0001; 0.13 μg, P = 0.0003; teko ya Fisher ye e nepagetšego, ya mahlakore a mabedi), mola 20E e bapetšwa le taolo Feela ka ditekanyo tše di phagamego (0.21 μg, P = 0.022; 0.13 μg, P = 0.0823; teko ya Fisher ye e nepagetšego, ya mahlakore a mabedi).3D20E e hlohleleditše ditekanyo tše di phagamego kudu tša go tswala go feta 20E ka ditekanyo tše di phagamego (0.21 μg, P = 0.0019; 0.13 μg, P = 0.075; teko ye e nepagetšego ya Fisher, ya mahlakore a mabedi).Ka diphaneleng ka moka, n e emela palo ya disampole tša monang tše di ikemetšego ka thutaphedi.NS, ga se ya bohlokwa.* P <0.05, ** P <0.01, ***P <0.001, ****P < 0.001.Data e tšwa go diphetolelo tše tharo.
Dithutong tša peleng, re ile ra bona gore phetišetšo ya thobalano ya dihomoune tša steroid e hlohleletša polelo ya MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), e lego lephelo la pelego la basadi leo le šireletšago ditshadi tša A. gambiae go tšwa go tshwaetšo ya P. falciparum Ditshenyagalelo tša maphelo tšeo di hlolwago ke 13, e lego parasite ya malaria ya batho yeo e bolayago kudu.Ge go filwe bohlokwa bja MISO go go swanelega ga pelego ga Anopheles ka mafelo a malaria-endemic, re ile ra tšea sephetho sa go bona gore ke homoune efe ya 3D20E goba 20E yeo e hlohleletšago polelo ya lephelo le.Re hweditše gore mola ente ya 20E ka go lebanya goba ka maatla e hlohleleditše di-receptor tše dingwe tša dihomoune tša nuclear (HR), tše bjalo ka HR3 le HR4, le diphetho tše di tlwaelegilego tša steroid tša ka tlase, tše bjalo ka dikarolwana tša leabela tša yolkogenic Vg14, 15, 16, MISO e be e le tše ntši ka matla e ile ya hlohleletšwa ke 3D20E (Extended Data Fig. 3).Ka go realo, phetišetšo ya thobalano ya homoune ye ya steroid ya androgenic e bonala e hlohleletša mekgwa yeo e šireletšago ditshadi go ditshenyagalelo tšeo di hlolwago ke tshwaetšo ya diphelakadingwe.Go feta moo, 3D20E e ama ka go fapana bobedi di-isoform tša E receptor EcR, e hlohleletša EcR-A le go gatelela EcR-B, le go hlohleletša ka maatla kudu dikarolwana tše dingwe tša leabela tšeo di hlohleletšago go nyalana, go akaretšwa HPX15, yeo e amago pelego ya basadi.Se se ka hlaloša go hloka thari mo go bohlokwa mo go lemogilwego go tše tshadi tšeo di nyalelanego le tše tona tšeo di homoditšwego ka EPP (Extended Data Fig. 3).Data ye e šišinya go ba gona ga ditsela tša ka tlase ga noka tšeo di kgethwago tšeo di šomišwago ke dihomoune tše pedi tša ecdysone tšeo di ka bago motheo wa mošomo wo o itšego wa bong.
Se se latelago, re ile ra leka mošomo wa dikarolwana tša leabela tše pedi tša EcK tšeo di hlaotšwego ka gare ga phaephe ya rena ya bioinformatics.Go homotša EcK1 goba EcK2 go feleleditše ka mahu a magolo go banna (Extended Data Fig. 4a), go šišinya gore ecdysone phosphorylation, gomme ka go realo go se šome, e bohlokwa bakeng sa go phologa.Ka gobane EcK2 e ile ya bontšhwa ka maemo a godimo go feta EcK1 gomme ya lemogwa ka go MAGs ke proteomics (Fig. 2b, c le Supplementary Table 2), re netefaditše mošomo wa yona wa ecdysteroid kinase ka go e duša ka 20E, yeo e feleleditšego ka phosphorylation 20E22P (Extended Data Figure 2).4b).Ge re šomiša 3D20E bjalo ka substrate, re be re sa kgone go utolla setšweletšwa sa phosphorylated 3D20E22P (Extended Data Fig. 4c), e šišinya gore 20E go e na le 3D20E e ka ba sepheo se se kgethilwego sa EcK2.
Ho ea ka and analysis rona RNA-seq, EcK2 e ne e boetse e bontšitsoe haholo ka LRT ea litšehali tse kgarebe, moo e ileng ea tima ka mor'a ho nyalana (Fig. 2b).Re netefalitse ya data tsena mme ra fumana hore polelo ea EcK2 e ne e sa ameha ke ho fepa ka mali (Extended Data Fig. 5a).Re atolosa liteko tsa rona tsa pele tsa MS, re ile ra etsa qeto ea hore tlhōrō ea 20E22P e ne e amana haufi le tlhōrō ya 20E (diiri tše 22-26 ka morago ga dijo tša madi; Extended Data Fig. 5b).Go homotša ga EcK2 go basadi ba kgarebe go feleleditše ka koketšego ya makga a 3 ya tekanyo ya go lekana ya 20E go 20E22P ka 26 h ka morago ga dijo tša madi (Extended Data Figures 2c le 5c), go tiišetša gore EcK2 gape e phosphorylates 20E ka ditshadi.Ka mo go lemogegago, dikgarebe tše di feletšwego ke EcK2 di bolokile go amogela thobalano ka botlalo (Extended Data Fig. 5d,e), go tšwela pele go šišinya gore tšweletšo ya tshadi ya 20E ga e hlohleletše dinako tša go se kgone go nyalana.Le ge go le bjalo, ditshadi tše di be di oketšegile kudu ditekanyo tša go beela mae ge di bapetšwa le taolo, ka go feta 30% ya dikgarebe tšeo di beelago mae (Extended Data Fig. 5f).Ge e le gore diente tša Eck2 RNA ya ditlhale tše pedi (dsEcK2) di dirilwe ka morago ga go fepa madi, go tswala ga se gwa direga, mo nakong yeo tlhora ya 20E ka lebaka la go metša madi e be e theogile.Ka kakaretšo, dipoelo tše di thekga mohlala wo 20E e tšweleditšwego ka morago ga go anya madi e ka hlohleletšago go tswala, eupša ke fela ge thibelo ya go tswala (EcK2 le mohlomongwe mabaka a mangwe) e retološwa tima ka go nyalana.Ga go diente tša 20E goba tša 3D20E tšeo di thibelago polelo ya EcK2 go dikgarebe (Extended Data Fig. 5g), e šišinya gore mabaka a mangwe a tsena gare ga thibelo ya kinase ye.Le ge go le bjalo, maemo a 20E ka morago ga go fepa madi a be a sa lekana go hlohleletša go se iketle ga go nyalana, eupša a be a hlohleletšwa ka mo go atlegilego ke titers tše di phagamego tša 3D20E yeo e fetišitšwego ka thobalano.
Dipoelo tša rena di fa temogo ye bohlokwa ka ga mekgwa yeo e laolago katlego ya pelego ya A. gambiae.Mohlala o tšweletše moo tše tona di hlabologilego go kopanya di-titer tše di phagamego tša 3D20E, e lego ecdysone ye e fetotšwego ye e itšego ya banna yeo e kgonthišetšago botswadi ka go dira gore ditshadi di se kwešiše go nyalana gape.Ka nako ye e swanago, diphetetši tše tša malaria le tšona di hlamile tshepedišo ye e šomago gabotse ya go dira gore e šome 3D20E go ditshadi go arabela phetišetšo ya thobalano ya EPP ye e itšego ya banna.Go ya ka tsebo ya rena, wo ke mohlala wa mathomo wa tshepedišo ya dihomoune tša steroid yeo e laolwago ke banna le basadi yeo e dirago mošomo wa moswananoši le wo bohlokwa go dikhunkhwane.Mošomo wa ecdysone wo o itšego wa banna o postulated eupša ga se wa bontšhwa ka mo go feletšego.Mohlala, kgopolokgolo yeo e ganetšago kudu 18 ke gore mešomo ye e ka dirwa ke 20E precursor E1.Go tsebega gabotse gore ka Drosophila, monandry e hlohleletšwa ke phetišetšo ya thobalano ya dipeptide tše nnyane tša thobalano19,20 tšeo di dirišanago le dinyurone tšeo di tsenyago methapo ya pampišana ya pelego ya basadi ka diamogedi tše itšego tša peptide ya thobalano21,22.Go nyakega mošomo wo mongwe go laetša di-cascade tša go laetša tša ka tlase tšeo di laolwago ke 3D20E ka go A. gambiae females le go bona ge eba di-cascade tše di ka bolokwa magareng ga menang le Drosophila.
Ka ge go filwe tema ye bohlokwa ya 3D20E go monono wa basadi le boitshwaro bjo bo lemogilwego mo nyakišišong ya rena, ditsela tšeo di išago go tswako le go tsenywa tirišong ga 3D20E di fa dibaka tše mpsha tša maano a taolo ya menang ya ka moso, go swana le go tšweletša tše tona tša phadišano tše di se nago malwetši ka maanong a theknolotši ya dikhunkhwane tše di se nago malwetši Šomiša go lokollwa ga hlaga goba go ekiša 3D20E ka papading ya kgarebe.The mošomo wo o itšego wa banna wa 3D20E o ka ba o tšweletše ge A. gambiae le mehuta ye mengwe ya Cellia e hwetša bokgoni bja go kgotlelela peu ya bona go ba dipolaki tša go nyalana, ka ge se se dumelela phetišetšo ye e šomago gabotse ya palo ye kgolo ya dihomoune le diensaeme tšeo di dirago gore dihomoune di šome.Ka lehlakoreng le lengwe, tlhagelelo ya 3D20E yeo e phethagatšago monandry e fa mokgwa wa gore ditshadi (ka polelo ya godimo ya MISO) go di rata go swanelega ga pelego mafelong ao a nago le go ata mo go phagamego ga malaria, yeo ka tsela ye e sa lebanyego e tsenyago letsogo go phetetšo ya Plasmodium.Ka ge go filwe gore 20E ya tshadi e bontšhitšwe go ba le ditlamorago tše kgolo go go phela le kgolo ya P. falciparum ka menang ya tshadi ya Anopheles,24 bobedi ditsela tša dihomoune tša steroid tša banna le tša basadi bjale ke dikarolo tše bohlokwa tša ditirišano tša monang le diphelakadingwe.
Mehuta ya A. gambiae G3 e ile ya godišwa ka fase ga maemo a maemo a dikhunkhwane (26-28 °C, 65-80% ya monola wa go lekana, 12:12 h seetša/lefsifsi photoperiod).Dibokwana di ile tša fepša ka dijo tša dihlapi tša lerole (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets le Tetra Pond Sticks ka tekanyo ya 7:7:2).E godilego menang e ile ya fepša ad libitum 10% ya tharollo ya dextrose le madi a batho a beke le beke (dikarolo tša madi a thuto).Menang ya kgarebe e hweditšwe ka go aroganya bong mo legatong la pupal ka morago ga go hlahloba mafelelo ka microscopy.Males a rwelego transgene ya DsRed e hlalošitšwe peleng.
Diteko tša go nyalana ka kgapeletšo di dirilwe go ya ka diprothokhole tše di hlalošitšwego peleng.Bakeng sa go nyalana ga tlhago, ditshadi tša kgarebe tša matšatši a 4 di be di bolokilwe ka tekanyo ya 1:3 le tše tona tša kgarebe tše di godilego ka thobalano mašego a mabedi.Bakeng sa diteko tšeo go tšona tše tona di ilego tša hlabja ka dsEPP, co-caging e ile ya sepelelana le matšatši a 3-4 ka morago ga go hlabja, ge mošomo wa phosphatase o be o homotšwa kudu (E okeditšwe Data Seh. 2b).
Dinamelwa tša menang, ditopo tše di šetšego (mmele ka moka), goba mmele ka moka di ile tša arolwa go ba 100% ya methanol gomme tša homogenized ka beader (2 mm dipheta tša khalase, 2,400 rpm, 90 sec).Dipalopalo tša dinama le dibolumo tša methanol di be di le ka tsela ye e latelago: mmele ka moka, 50 ka 1,000 μl; MAG, 50-100 80 μl ya go swana le ya; female LRT, 25–50 80 μl.The precipitate ile tlas'a bobeli methanol go ntšhwa ka bophahamo ba modumo e tšoanang ea methanol.Cell debris ile tlosoa ka centrifugation.The methanol ho tloha bobeli extractions ile kopanya le omisitsoeng tlas'a naetrotšene phallo, ebe resuspended ka dibolumo tse latelang tsa 80% methanol ka metsi: ba bang kaofela ba 'mele, 50 μl ya; MAGs le LRT e tšehali, 30 μl.
Disampole di ile tša sekaseka ka spectrometer ya boima (ID-X, Thermo Fisher) yeo e kopantšwego le sedirišwa sa LC (Vanquish, Thermo Fisher).5 μl ya sampole e ile ya hlabja godimo ga kholomo ya 3 μm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) yeo e hlokometšwego ka 25 °C.Dikgato tše di sepelago tša LC e be e le A (meetse, 0.1%). formic acid) le B (acetonitrile, 0.1% formic acid).The LC gradient e ne e le ka tsela e latelang: 5% B bakeng sa motsotso o le mong, ebe eketseha ho 100% B ka metsotso e 11.Ka mor'a metsotso e 8 ka 100%, boela leka-lekanya kholomo ka 5% B bakeng sa metsotso e 4.The phallo sekhahla e ne e le 0.3 ml min-1.Ionization ka MS mohloli ke phethagatšwa ka go fiša electrospray ionization ka mekgwa e mebotse le e mpe.
The boima spectrometer mehato ya data ka m / z fapaneng ho tloha 350 ho 680 ka 60,000 qeto ka feletseng MS mode.MS / MS ya data ba ile ba fumana ka [M + H] + (dipheo tsohle), [M - H2O + H] + (dipheo tsohle), le [M - H]- (dipheo phosphorylated).MS / MS ya data ile sebediswa ho tiisa thepa ecdysone ya lipheo bakeng sa eo ho se nang maemo e be e le gona.Go hlaola di-ecdysteroid tšeo di sa nepišwago, ya data ya MS/MS ya ditlhora ka moka tša HPLC tšeo di nago le >15% ya bontši bjo bo lekanyeditšwego di ile tša sekaseka.Quantify ka go šomiša dikhube tša maemo tšeo di hlotšwego go tšwa go maemo a hlwekilego (20E, 3D20E) go bala palo ye e feletšego goba dilutions tša sampole e tee ye e itšego (dipheo tše dingwe ka moka) go bala go lekana ga tšona le palo yeo e hweditšwego ka gare ga male e tee.Bakeng sa 3D20E, quantification ile etsoa sebelisa palo yohle ya adducts latelang: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na] +, [M + Cl]-, [M + NO3]-.Data ba ile ba ntša le quantified sebelisa Tracefinder (phetolelo 4.1).MS / MS ya data ba ile ba sekaseka sebelisa Xcalibur (phetolelo 4.4).The MS spectra ya E, 20E le 3D20E ba ile ba bapisoa le maemo a ka ho latelana.3D20E22P ile sekaseka ka derivatization le Girard o reagent.20E22P ile sekaseka ka m / z karo-karolelano.
3D20E22P e ile ya hlwekišwa go tšwa go MAG.Purification e dirilwe ka tekanyo ya tshekatsheko ka go šomiša chromatograph ya seela ya ultra-performance (Acquity, Waters) ka sešuthi seo se theilwego godimo ga boima bja quadrupole (QDa, Acquity, Waters) ka fase ga maemo a LC a swanago le a tshekatsheko ya HPLC-MS/MS.Fraction kgoboketšo e ile ya hlohleletša ge m/z yeo e sepelelanago le 3D20E22P e ile ya lemogwa ka nako ye e swanago ya go boloka bjalo ka ge e be e beilwe peleng.Bohlweki bja metswako ye e ntšhitšwego bo ile bja hlahlobja ka morago ka HPLC-MS/MS bjalo ka ge go hlalošitšwe ka mo godimo.
Palomoka ya RNA e ile ya ntšhwa go tšwa go dinama tše 10-12 tša pelego goba dikarolong tše dingwe tša mmele (tše di se nago hlogo) ka go šomiša TRI reagent (Thermo Fisher) go latela ditaelo tša motšweletši.RNA e ile ya alafša ka TURBO DNase (Thermo Fisher).cDNA e ile ya hlangwa ka go šomiša Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) go latela ditaelo tša motšweletši.Di-primer tša go bušetša morago transcription quantitative PCR (RT-qPCR; Extended Data Table 2) di be di phatlaladitšwe peleng24 goba di hlamilwe ka go šomiša Primer-BLAST26, ka kgetho yeo e filwego ditšweletšwa tša 70-150 bp ka bogolo le go akaretša dikgokagano tša exon-exon goba di-primer tša para ya Primer di aroganya di-exon.cDNA disampole go tšwa go dišupo tše tharo go ya go tše nne tša thutaphedi di ile tša hlapološwa ka makga a mane ka meetseng bakeng sa RT-qPCR.Quantification e dirilwe ka dikarabelo tša go tšweletša gape tše 15 μl tšeo di nago le 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), di-primer, le 5 μl ya cDNA yeo e hlapolotšwego.Dikarabelo di ile tša sepetšwa ka tshepedišo ya nako ya nnete ya PCR ya QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) gomme ya data ya kgoboketšwa le go sekaseka ka go šomiša Design le Tshekatsheko (phetolelo 2.4.3).Bjalo ka ge go bontšhitšwe mo nyakišišong ye, dipalo tše di lekanyeditšwego di ile tša tlwaetšwa go lephelo la ribosomal RpL19 (AGAP004422), leo polelo ya lona e sa fetogego kudu ka go fepa madi 27 goba go nyalana 3 .
Boleng bja RNA bo ile bja hlahlobja ka go šomiša Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent).Dilaeborari tša go ba le dipara tša Illumina di ile tša lokišetša le go sepedišwa ka Broad Institute of MIT le Harvard.Sequencing reads di ile tša logaganywa le genome ya A. gambiae (PEST strain, version 4.12) ka go šomiša HISAT2 (phetolelo ya 2.0.5) ka ditekanyetšo tša default.Reads with default mapping quality (MAPQ) lintlha <30 ba ile ba tlosoa sebelisa Samtools (phetolelo 1.3.1).Palo ea bala mapped ho liphatsa tsa lefutso ile balwa sebelisa htseq-bala (phetolelo 0.9.1) le default ditekanyetos.Normalized bala bala ba ile ba balwa le phapang liphatsa tsa lefutso polelo sekaseka sebelisa DESeq2 sephutheloana (phetolelo 1.28.1) ka R (phetolelo 4.0.3).
Ecdysone-fetola liphatsa tsa lefutso bonkgetheng ba ile ba hlwaya ka pele batla A. gambiae genome sebelisa PSI-BLAST algorithm (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast +/2.8.1/), sebelisa default boleng Parameters le latelang potso diprotheine tatelano: ho tloha Bombyx mori (Accession No. NP_001038956.1), Musca domestica (Nomoro ya Phihlelelo XP_005182020.1, XP_005175332.1 le XP_011294434.1) le sedirišwa sa go phušola sa Microplitis (Nomoro ya Phihlelelo XP_005182020.1 le XP_0008552645.1)) EcK go tšwa go B. mori (No. le EPP go tšwa go B. mori (Accession No. XP_001947166) NP_001177919.1 le NP_001243996.1) le EO ya D. melanogaster (Accession No. NP_572986.1) (mohato 1).Next, filtara hits e thehiloeng phahameng mRNA polelo (> 100 dikarolwana/kilobase exons ka milione mmapa bala (FPKM) kapa >85%) ka dinama tse nyenyane tse pelehi (tshadi LRT kapa MAG) ka Gambia (mohato 2 ). Go kaonafatša go kgethegile, re ile ra kgetha diensaeme tša nkgetheng tšeo gape di bontšhwago ka gare ga dinama tša pelego tša A. albimanus, e lego mohuta wa anopheles wo o sa hlamego goba wa fetišetša ecdysone nakong ya go nyalana.Dipshio tša nkgetheng di ile tša sefiwa go ya ka polelo ya fase (<100 FPKM goba <85th percentile) ka gare ga dinama tša pelego tša A. albimanus (kgato ya 3).As a final filter (mohato 4), nkgetheng liphatsa tsa lefutso hloka ho khotsofatsa bonyane e mong oa tse latelang: (1) haholo ho fihlela-laoloa ka mor'a ho nyalana (P <0.05) ho ea ka and analysis ya differentially bontšitsoeng liphatsa tsa lefutso le (2) ka dinama tse nyenyane tse bao e seng pelehi (< 85 % kapa <100 FPKM).
Re fetotše mekgwa yeo e hlalošitšwego peleng 28,29,30 go fihlelela go swaya isotopic ya sephedi ka moka.Ka boripana, mohuteng wa hlaga wa Saccharomyces cerevisiae mohuteng wa II (YSC2, Sigma) o ile wa lekwa ka motheong wa naetrotšene ya tomoso (BD Difco, DF0335) yeo e nago le (wt/vol) 2% ya glucose (G7528, Sigma), 1.7%. amino acid-free le ammonium sulfate. setšo sa magareng) le 5% 15N ammonium sulfate (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) bjalo ka mothopo o nnoši wa naetrotšene.Tomoso e ile ya bušetšwa ka centrifugation gomme dibokwana tša menang di ile tša fepša ad libitum go fihlela di pupation.Tlaleletšo ka bupi bja hlapi (0.5 mg ka dibokwana tše 300) go thibela instar ya bone mortality.Ke ditshadi fela tšeo di ilego tša šomišwa ka morago ka ditekolong tša go nyalana le tše tona tše di sa swaiwago go sekaseka proteome ya tona yeo e fetišitšwego nakong ya go nyalana.
Ditshadi tša kgarebe tše di swailwego ka 15N tša matšatši a 4-6 di ile tša gapeletšega go nyalana le tše tona tša kgarebe tše di sa swaiwago tšeo di lekanago le mengwaga.Go nyalana ka katlego go ile gwa netefatšwa ka go utolla dipolaki tša go nyalana ka fase ga microscopy ya epifluorescence.Ka 3, 12, le 24 hpm, diatria tša ditshadi tše 45-55 tše di nyalanego di ile tša arolwa ka gare ga 50 μl ya ammonium bicarbonate buffer (pH 7.8) le homogenized ka pestle.The homogenate ile centrifuged le supernatant hlakanywa le 50 μl ya 0.1% RapiGest (186001860, Meetse) ka 50 mM ammonium bicarbonate.The supernatant le pellet ho tloha sampole e 'ngoe le e' ngoe ba ile ba snap frozen ka leqhoa o omileng le romelwa bosiu bosiu ho MacCoss laboratori Yunibesithing ea Washington, moo sampole ho lokisetsa bakeng sa LC-MS / MS ile phethoa.Resuspend pellet ka 50 μl ya 0.1% RapiGest ka 50 mM ammonium bicarbonate le sonicate ka metsi bath.The protheine mahloriso ya pellet le supernatant ile lekanngoa ke BCA assay, disampole di ile tša fokotšwa ka 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), alkylated le 15 mM iodoacetamide (Sigma) le incubated ka 37 ° C (1: 0 50) bakeng sa hora e le 1 le trypsinization: trypsin:substrate karo-karolelano).RapiGest ile lysed ka go tlaleletsa ka 200 mM HCl, lateloa ke dušwa ka 37 ° C bakeng sa metsotso e 45 le centrifugation ka 14,000 rpm ka metsotso ye 10 ka 4 °C go tloša ditlakala.Disampole di ile tša hlatswiwa ka go ntšhwa ga kgato ye e tiilego ya mokgwa wo mobedi (dikhathune tša Oasis MCX, Meetse) gomme tša emišwa gape ka gare ga 0.1% ya esiti ya formic bakeng sa mahloriso a mafelelo a proteine ​​ya 0.33 μg μl-1.Diproteome tša MAG tše di sa swaiwago di ile tša sekaseka ka mo go swanago go tšwa go kgarebe banna.Diphetolelo tše pedi tša tshekatsheko di ile tša sekaseka bakeng sa sampole ye nngwe le ye nngwe.Se se latelago, 1 μg ya ye nngwe le ye nngwe e ile ya sekaseka ka go šomiša kholomo ya 25-cm ya silika ye e kopantšwego ya 75-μm ka sefero sa frit sa silica ye e kopantšwego sa 4-cm seo se tletšego ka Jupiter C12 reversed-phase resin (Phenomenex) le chromatography ya seela ya metsotso ye 180. Sample digests – MS/MS e ile ya sepetšwa ka Q-Exactive HF mass spectrometer (Thermo Fisher) ka nanoACQUITY UPLC System (Waters).Data ya go hwetša ye e amanago le datha yeo e tšweleditšwego bakeng sa go kitima mo gongwe le mo gongwe e ile ya fetošetšwa go sebopego sa mzML ka go šomiša Proteowizard (phetolelo ya 3.0.20287) le go šomiša Comet31 (phetolelo ya 3.2) kgahlanong le polokelo ya tshedimošo ya FASTA yeo e nago le proteine tatelano go tšwa go Anopheles gambiae (VectorBase phetolelo 54), Anopheles coluzzi Go ile gwa dirwa nyakišišo go Mali-NIH (VectorBase phetolelo 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, March 2021), A. gambiae RNA-seq, le diphetolelo tša foreime tše tharo tša ditšhila tša batho tše di tsebjago.Di-FDR tšeo di nyalelanago le mmapa wa peptide di ile tša laolwa ka go šomiša Percolator32 (phetolelo 3.05) ka moedi wa 0.01, gomme dipeptide di ile tša kgoboketšwa ka gare ga ditšhupetšo tša proteine ​​ka go šomiša parsimony ya proteine ​​ka go Limelight33 (phetolelo 2.2.0).Bongata bja proteine ​​bja go lekana bo ile bja akanyetšwa ka go šomiša selo sa bontši bja spectral bjo bo tlwaelegilego (NSAF) seo se balwago bakeng sa proteine ​​ye nngwe le ye nngwe ka go kitima go gongwe le go gongwe bjalo ka ge go hlalošitšwe peleng.NSAF ge e bapetšwa le proteine ​​ye nngwe le ye nngwe e be e arotšwe ka palogare go ralala le disampole tše pedi tše di fapanego tša thutaphedi replicates.15N go swaya ka katlego masked proteome ya basadi, le ge e le gore palo ye nnyane ya proteine ​​ye e sa swaiwago e be e ka lemogwa go tšwa go dikgarebe tše di swailwego.Re ngwadile go lemogwa ga phokotšo ya proteine ​​ya banna (1-5 spectra) ka disampole tše tala tša basadi fela ka go kitima ga setegeniki, moo disampole tše tala di ilego tša sepetšwa ka morago ga disampole tša tona/go nyalana, ka lebaka la diproteine ​​tša HPLC “go rwala godimo”.Ka dinako tše dingwe diproteine ​​tše di hweditšwego bjalo ka ‘ditšhilafatšo’ go tšwa go dikgarebe tše di swailwego di lokeleditšwe go Lenaneo la Tlaleletšo 1.
Dipeptide tše pedi tša antigenic, QTTDRVAPAPDQQQ (ka gare ga isotype PA) le MESDGTTPSGDSEQ (ka gare ga isotype PA le PB) ka go Genscript.Dipeptide tše pedi di ile tša kopanywa, ke moka tša kopanywa le proteine ​​ya mojari KLH gomme tša hlabja ka gare ga mebutla ya New Zealand.Mebutla e ile ya dirwa sehlabelo ka morago ga ente ya bone, gomme palomoka ya IgG e ile ya arolwa ka kamano purification.IgG go tšwa go mmutla wo o itšego kudu wa EPP e ile ya šomišwa go western blotting ye nngwe.
Bakeng sa di-blot tša bodikela, MAG (n = 10, moo n e emelago palo ya dišupo tša menang tše di ikemetšego ka thutaphedi) le LRT ya tshadi (n = 30) go tšwa go tše tona tša kgarebe tša matšatši a 4 le tše tshadi tša kgarebe goba tšeo di nyalanego ka kgapeletšo (<10 ka morago ga go nyalana), Protein extraction buffer (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate;150 mM NaCl;1 mM EDTA; °C.Diproteine ​​di ile tša balwa ka Bradford assay (Bio-Rad).Ka morago, 20 μg ya proteine ​​ya MAG, 40 μg ya proteine ​​ya LRT, le 20 μg ya proteine ​​ya bontši bja mašaledi di ile tša denatured gomme tša arolwa ka 10% Bis-Tris NuPAGE ka go šomiša MOPS buffer.Diproteine ​​di ile tša fetišetšwa go dimembrane tša polyvinylidene fluoride ka go šomiša phetišetšo ya iBlot2 tshepedišo (Thermo Fisher).Dimembrane di ile tša hlatswiwa gabedi ka gare ga 1 × PBS-T (0.1% Tween-20 ka go PBS) gomme ka morago tša thibelwa ka gare ga Odyssey blocking buffer (Li-Cor) ka iri ye 1 ka 22°C.Membranes di ile tša šišinywa bošego ka moka ka 4 °C ka mmutla wa tlwaelo anti-EPP polyclonal primary antibody (1:700 ka gare ga buffer ya go thibela) le mmutla anti-actin monoclonal primary antibody MAC237 (Abeam; 1:4,000).Dimembrane di ile tša hlatswiwa ka PBS-T gomme ka morago tša bjalwa ka dithibela-maikwelo tša bobedi (tokolo ya go lwantšha mmutla 800CW le pudi ya go lwantšha rat 680LT (Li-Cor), bobedi 1:20,000) ka gare ga buffer ya go thibela yeo e nago le 0.01% SDS le 0.2%. Tween -20 ka iri e tee ka 22 °C.Dimembrane di ile tša hlatswiwa ka PBS-T gomme tša tšewa diswantšho ka skena sa Odyssey CLx.Diswantšho di ile tša kgoboketšwa le go šongwa ka go Image Studio (phetolelo ya 5.2).Sehlopha se se itšego seo se sepelelanago le isoform ya EPP-RA (82 kDa) ga se sa lemogwa.
Dilete tša go ngwala khoutu tša EPP (bjalo ka isoform AGAP002463-RB yeo e nago le domain ya histidine phosphatase, nyakišišo ya domain ye e bolokilwego ya NCBI 34) le EcK2 (AGAP002181) di ile tša cloned ka gare ga plasmid ya pET-21a (+) (Novagen Millipore Sigma) ; di-primer di lokeleditšwe ka go Lenaneo la Datha ye e Atološitšwego 2.Dikgokagano tše seswai tša GS4 (ka tandem) di ile tša tsenywa pele ga tag ya C-terminal 6xHis ya pET-21a (+)-EcK2 construct.Diprotheine tša go kopanywa gape di tšweleditšwe ka go šomiša karabelo ya tswako ya proteine ​​ya E. coli yeo e se nago disele tša NEBExpress (New England BioLabs).Diprotheine tše di kopantšwego gape di ile tša hlwekišwa ka go šomiša dikholomo tša NEBExpress Ni spin (New England BioLabs).Proteine ​​ya taolo ya dihydrofolate reductase (DHFR) e tšweleditšwe ka go šomiša thempleite ya DNA go tšwa go NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit.Diproteine ​​di ile tša bolokwa ka gare ga 50% ya glycerol ka gare ga PBS ka -20 °C go fihla dikgweding tše 3.
Phosphatase mosebetsi wa EPP le dinama tse nyenyane tse ditsopolwa ile lekanngoa sebelisa 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich).The karabelo buffer e ne e na le 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, le 1 mM DTT.Tissue ile homogenized ka karabelo buffer le ditlakala tša sele di ile tša tlošwa ka centrifugation.Initiate karabelo ka go oketša ensaeme goba setsopolwa sa dinama go buffer ya karabelo yeo e nago le 2.5 mg ml-1 pNPP.Motswako wa karabelo o ile wa bjalwa ka themperetšheng ya phapoši leswiswing, gomme palo ya pNP yeo e fetotšwego go tšwa go pNPP e ile ya balwa ka go ela absorbance ka 405 nm ka dinako tše di fapanego.
Bakeng sa mošomo wa EcK wa ka gare ga vitro, proteine ​​e ile ya bjalwa ka 0.2 mg 20E goba 3D20E ka gare ga 200 μl buffer (pH 7.5) yeo e nago le 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP le 10 mM MgCl2 ka 2 h ka 27 °C .Karabelo e ile ya emišwa ka go oketša 800 μl methanol, ka morago ya fodišwa ka -20 °C ka iri ye 1, ke moka ya centrifuged ka 20,000 g ka metsotso ye 10 ka 4 °C.The supernatant e ile ya hlahlobja ka morago ka HPLC-MS/MS.To mocheso-inactivate diprotheine tše di šomišitšwego sehlopheng sa taolo, diproteine ​​di ile tša bjalwa ka gare ga 50% glycerol ka PBS ka 20 min ka 95°C.
Bakeng sa mošomo wa EPP wa ka gare ga vitro, proteine ​​e ile ya bjalwa ka 3D20E22P (e lekanago le palo yeo e hweditšwego ka gare ga dipara tše 18 tša MAG, yeo e hlwekišitšwego ka HPLC-MS/MS) ka gare ga 100 μl buffer (pH 7.5) yeo e nago le 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, . 0.1 mM EDTA, le 1 mM DTT ka diiri tše 3 ka 27 °C.Karabelo e ile ya emišwa ka go tlaleletša ka 400 μl ya methanol gomme ya fodišwa ka -20 °C ka iri ye 1, ke moka ya centrifuged ka 20,000 g ka metsotso ye 10 ka 4 °C.The supernatant e ile ya sekaseka ka HPLC-MS/MS.
Dikarolwana tša PCR tša EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) le EcK2 (556 bp) di ile tša godišwa go tšwa go cDNA yeo e lokišitšwego go tšwa go ditopo tša menang tše di se nago dihlogo tša bong bjo bo hlakantšwego.Karolwana ya PCR ya taolo ya eGFP (495 bp) e ile ya godišwa go tšwa go pCR2.1-eGFP yeo e hlalošitšwego peleng; Di-primer tša PCR di lokeleditšwe ka go Lenaneo la Datha ye e Atološitšwego 2.Karolwana ya PCR e ile ya tsenywa magareng ga dihlohleletši tša T7 tše di fetotšwego godimo ga plasmid ya pL4440.Dipopego tša plasmid di ile tša hwetšwa go tšwa go E. coli ye e nago le bokgoni bja NEB 5-α (New England Biolabs) gomme tša netefatšwa ka tatelano ya DNA pele ga tšhomišo (bona Datha ya Tlaleletšo 1 bakeng sa tatelano ya go tsenya).Di-primer di ile tša swana le motšweletši wa T7 (Extended Data Table 2) di ile tša šomišwa go godiša go tsenywa go tšwa go pL4440-based plasmid.PCR setšweletšwa bogolo bo ile bja tiišetšwa ka agarose gel electrophoresis.dsRNA e ile ya ngwalwa go tšwa go dithempleite tša PCR ka go šomiša Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) gomme ya hlwekišwa go ya ka ditaelo tša motšweletši ka diphetogo tšeo di hlalošitšwego peleng.
Bakeng sa ente ya dsRNA, 1,380 ng ya dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) e ile ya hlabja ka mahloriso a 10 ng nl-1 ka gare ga thorax ya banna ba bagolo goba basadi (Nanoject III, Drummond) ka gare ga letšatši le tee ka morago ga eclosion.Maemo a go knockdown a dikarolwana tša leabela a ile a laolwa ka bonyane diphetolelo tše tharo tša thutaphedi ka RNA go ntšhwa, tswako ya cDNA, le RT-qPCR.Bakeng sa ente ya ecdysone, ditshadi tša matšatši a 4 tša kgarebe goba tša matšatši a 6 tša kgarebe tšeo di fepilwego ka madi di ile tša hlabja ka 0.13, 0.21, goba 0.63 μg ya 20E goba 3D20E (Nanoject III, Drummond) ka ditekanyetšo tša 1.3, 2.1, . ka go latelelana, go ya ka tlhamo ya teko goba 6.3 ng nl-1.Inject 100 nl ya 10% (vol/vol) ethanol ka meetseng; 100 nl ya 3D20E22P ka gare ga 10% ya ethanol (e lekanago le 75% ya palo yeo e hweditšwego ka gare ga para ya MAGs).Menang e ile ya abelwa ka go se kgethe sehlopheng sa ente.
Bakeng sa diteko tša go tswala, ditshadi tša matšatši a 3 di ile tša fepša ad libitum mading a motho.Tloša menang yeo e fepilwego ka bontši goba yeo e sa fepšago.Go ya ka kalafo, tše tshadi di be di bewa ka gare ga dikomiki tša go tswala tše di aroganego mašego a mane bonyenyane diiri tše 48 ka morago ga dijo tša madi.Mae a ile a balwa ka fase ga stereoscope (Stemi 508, Zeiss); go tše tshadi tše di nyalanago, mae ao a thuthušwago go ba dibokwana a be a lebelelwa e le a nonnego.
Bakeng sa diteko tša go nyalana, tše tshadi di ile tša dumelelwa bonyane matšatši a 2 go ya ka kalafo go hlagolela go ganetša go nyalana, gomme tše tona tša mohuteng wa hlaga tšeo di swanago le mengwaga di ile tša tsenywa ka morago ga moo ka lesaka le tee.Mašego a mabedi ka morago, di-vesicles tše di nontšhitšwego tša basadi di ile tša arolwa gomme DNA ya genomic ya lokollwa ka go gatsela-thaw le sonication ka gare ga buffer yeo e nago le 10 mM Tris-HCl, . 1 mM EDTA, le 25 mM NaCl (pH 8.2).Disampole di ile tša bjalwa ka Proteinase K (0.86 μg μl-1) ka metsotso ye 15 ka 55 °C, gomme ya latelwa ke metsotso ye 10 ka 95 °C.Dipeakanyo tša DNA tša genomic tše tala di ile tša hlapološwa ka makga a 10 gomme tša bewa ka fase ga go lemogwa ga qPCR ga tatelano ya Y chromosome; di-primer di lokeleditšwe ka go Lenaneo la Datha ye e Atološitšwego 2.Go se be gona ga tatelano ya di-chromosome tša Y go laetša gore ga go na go nyalana.
Bakeng sa diteko tša go nyalana gape, ditshadi tše di nyalanego ka kgapeletšo di ile tša hlahlobja go ba gona ga dipolaki tša go nyalana go tiišetša maemo a go nyalana gomme tša dumelelwa matšatši a 2 go hlabolla go se kgone go nyalana ge tše tona di se gona, bjalo ka ge go hlalošitšwe peleng 36 .Ditona tše di rwelego peu ya DsRed transgenic di ile tša tsenywa ka morago ka dihokong tša basadi.Mašego a mabedi ka morago, divesike tša go nontšha di ile tša tsenywa dissected go tšwa go tše tshadi, gomme DNA ya genomic e ile ya lokišetšwa bjalo ka ge go hlalošitšwe ka mo godimo gomme ya bewa ka fase ga go lemogwa ga qPCR ga transgene ya DsRed; di-primer di lokeleditšwe ka go Lenaneo la Datha ye e Atološitšwego 2.Go se be gona ga transgene ya DsRed go laeditše gore ga go na go nyalana gape mo go diregilego.
3D20E e ile ya hlangwa bjalo ka ge go hlalošitšwe peleng 37 .Ka boripana, 10 mg ya 20E (Sigma-Aldrich) e ile ya hlapološwa ka gare ga 10 ml ya meetse, ya latelwa ke go tlaleletšwa ga 30 mg ya polatinamo ye ntsho (ka mokgwa wa phofo, Sigma-Aldrich).Moela wo boleta wa O2 o ile wa bubbled ka go tšwela pele ka gare ga motswako wa karabelo, wo o ilego wa hlohleletšwa ka phapošing themperetšha.Ka morago ga diiri tše 6, 30 mL ya methanol e ile ya tlaleletšwa go emiša karabelo.Motswako o ile wa centrifuged go tloša dikarolwana tša sešušumeletši.Supernatant e ile ya moyafala go fihla e oma ka gare ga lefeela ka themperetšha ya phapoši.Setšweletšwa sa karabelo ye e omilego se ile sa hlapološwa ka gare ga 10% ya ethanol le methanol bakeng sa go hlabja bakeng sa tshekatsheko ya HPLC-MS/MS.Seelo sa phetošo (go tloga go 20E go ya go 3D20E) e be e le mo e ka bago 97% (Fig. 4b), gomme sepektheramo sa MS sa 3D20E ye e hlamilwego se be se swana le seo se hwetšwago go ditshadi tše di nyalanego (Fig. 4c).
Tšhaba e na le dintlha tše di itšego tša diteko tša dipalopalo tšeo di dirilwego.GraphPad (phetolelo ya 9.0) e ile ya šomišwa go dira teko ya go nepagala ya Fisher, teko ya Mantel-Cox, le teko ya t ya Student.Diteko tša Cochran-Mantel-Haenszel di dirilwe ka go šomiša mongwalo wa R wa tlwaelo (wo o hwetšagalago go https://github.com/duopeng/mantelhaen.test).Kabo ya data e ile ya lekwa bakeng sa tlwaelo ka go šomiša teko ya Shapiro-Wilk ka moedi wa bohlokwa wa 0.05.Ge ya data e paletšwe ke teko ya go tlwaelega, teko ya Mann-Whitney e ile ya dirwa.Ya data ya go phologa e ile ya sekaseka ka go šomiša teko ya Mantel-Cox.Sephuthelwana sa DESeq2 (phetolelo 1.28.1) se ile sa šomišwa go dira tshekatsheko ya polelo ya phapano ya maemo a dikarolwana tša leabela tša RNA-seq.Bareng ye e rapaletšego godimo ga kerafo e emela median.A boleng bja bohlokwa bja P = 0.05 bo ile bja šomišwa bjalo ka moedi wa diteko ka moka.
Bakeng sa tshedimošo ye ntši ka ga tlhamo ya nyakišišo, bona abstract ya Pego ya Nyakišišo ya Tlhago yeo e kgokagantšwego le sehlogo se.
Datha ya proteomic ya MS e ile ya bewa ka gare ga Consortium ya ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ka Polokelo ya Molekane ya PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) ka sešupo sa dataset PXD032157.
The RNA-seq dataset e behiloe ka Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) tlas'a rekoto seriale GSE198665.
Disete tša datha tša tlaleletšo tšeo di tšweleditšwego le/goba tšeo di sekasekilwego nakong ya nyakišišo ya bjale di ka hwetšwa go tšwa go bangwadi bao ba swanetšego ka kgopelo ye e kwagalago.Athikele ye e fa datha ya mothopo.
De Loof, A. Ecdysteroids: Di-steroid tša thobalano tša dikhunkhwane tše di hlokomologilwego?Male: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone le kgolo ya mae a dikgogo ka go Anopheles stephens.J. Fisioloji ya Dikhunkhwane.28, 97-109 (1982).