Di- metabolite tša go fetoša masole a mmele ke tšobotsi e bohlokwa ya tikologo e nyenyane ya hlagala (TME), eupša ka ntle le tše sego kae, boitšhupo bja tšona bo sa dutše bo sa tsebje kudu. Mo, re ile ra sekaseka dihlagala le disele tša T go tšwa go dihlagala le ascites ya balwetši bao ba nago le kankere ya serous ya maemo a godimo (HGSC) go utolla metabolome ya dikarolo tše tše di fapanego tša TME. Ascites le disele tša hlagala di na le diphapano tše kgolo tša metabolite. Ge go bapetšwa le ascites, disele tša T tšeo di tsenelelago hlagala di humišitšwe kudu ka 1-methylnicotinamide (MNA). Le ge e le gore maemo a MNA ka diseleng tša T a phagame, polelo ya nicotinamide N-methyltransferase (ensaeme yeo e hlohleletšago phetišetšo ya dihlopha tša methyl go tšwa go S-adenosylmethionine go ya go nicotinamide) e lekanyeditšwe go di-fibroblast le disele tša hlagala. Ka mošomo, MNA e hlohleletša disele tša T go ntšha cytokine yeo e kgothaletšago hlagala ya tumor necrosis factor alpha. Ka fao, MNA yeo e tšwago go TME e tlaleletša go taolo ya boitshireletšo bja mmele bja disele tša T gomme e emela sepheo seo se ka bago gona sa kalafo ya masole a mmele bakeng sa kalafo ya kankere ya batho.
Di- metabolite tšeo di tšwago go hlagala di ka ba le mafelelo a tseneletšego a thibelo go itšhireletša ga mmele go lwantšha hlagala, gomme bohlatse bjo bo oketšegilego bo bontšha gore gape di ka šoma e le matla a bohlokwa ao a tutuetšago tšwelopele ya bolwetši (1). Go tlaleletša go mafelelo a Warburg, mošomo wa morago bjale o thomile go hlaola boemo bja metaboliki bja disele tša hlagala le tswalano ya yona le boemo bja masole a mmele bja microenvironment ya hlagala (TME). Dinyakišišo tša dika tša dipeba le disele tša T tša batho di bontšhitše gore metabolism ya glutamine (2), metabolism ya oxidative (3) le metabolism ya glucose (4) di ka šoma ka go ikemela go dihlopha tše di fapanego tša disele tša masole a mmele. Di- metabolite tše mmalwa ditseleng tše di thibela mošomo wa go lwantšha hlagala wa disele tša T. Go hlatsetšwe gore thibelo ya coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) e ka senya go ata ga disele tša T, gomme koketšego ya BH4 mmeleng e ka godiša karabelo ya masole a mmele ya go lwantšha hlagala yeo e tsenywago gare ke CD4 le CD8. Go tlaleletša, phello ya immunosuppressive ya kynurenine e ka phološwa ka go newa ga BH4 ( 5 ). Ka isocitrate dehydrogenase (IDH) mutant glioblastoma, secretion ya enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) thibela T sele kenya tshebetsong, ho ata le cytolysis Activity (6). Morago bjale, go bontšhitšwe gore methylglyoxal, setšweletšwa sa ka thoko sa glycolysis, e tšweletšwa ke disele tša suppressor tša setlogo sa myeloid, gomme phetišetšo ya disele tša T tša methylglyoxal e ka thibela mošomo wa sele ya T ya effector. Ka kalafo, neutralization ya methylglyoxal ka hlōla mosebetsi oa myeloid-e tswang suppressor lisele tse (MDSC) le synergistically ntlafatsa checkpoint blockade kalafo ka dikai toeba (7). Dinyakišišo tše ka kakaretšo di gatelela tema ye bohlokwa ya dimetabolite tše di tšwago go TME go laola mošomo le mošomo wa disele tša T.
Go se šome gabotse ga disele tša T go begilwe kudu kankereng ya mae a dikgogo ( 8 ). Se se bakwa ka karolo ke dimelo tša metaboliki tšeo di lego ka gare ga hypoxia le methapo ya hlagala ye e sa tlwaelegago (9), yeo e feleletšago ka go fetošwa ga glucose le tryptophan go ba ditšweletšwa tša ka thoko tša go swana le esiti ya lactic le kynurenine. Lactate e feteletšego ya ka ntle ga sele e fokotša tšweletšo ya interferon-γ (IFN-γ) gomme e otlela phapano ya dihlopha tše nnyane tša myelosuppressive ( 10 , 11 ). Tšhomišo ya tryptophan e thibela ka go lebanya go ata ga disele tša T gomme e thibela go laetša ga seamogedi sa disele tša T ( 12-14 ). Go sa šetšwe dilo tše tšeo di hlokometšwego, mošomo wo montši wo o dikologilego metabolism ya boitshireletšo bja mmele o ile wa phethwa ka gare ga setšo sa disele tša T tša ka gare ga vitro ka go šomiša methopo ya ditaba ye e lokišitšwego, goba e lekanyeditšwe go dika tša dipeba tša homologous ka vivo, ga go le e tee ya tšona yeo e bontšhago ka botlalo go se swane ga dikankere tša batho le tikologo ya macro le micro ya Mmele.
Sebopego se se tlwaelegilego sa kankere ya mae a dikgogo ke go phatlalala ga peritoneal le ponagalo ya ascites. Go kgoboketšwa ga seela sa sele ka gare ga ascites go tswalanywa le bolwetši bjo bo tšwetšego pele le ponelopele e fokolago ( 15 ). Go ya ka dipego, lefelo le la moswananoši le na le hypoxic, le na le maemo a godimo a vascular endothelial growth factor (VEGF) le indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), gomme le tsentšwe ke disele tša taolo tša T le disele tša thibelo ya myeloid ( 15-18 ). Tikologo ya metaboliki ya ascites e ka ba e fapane le ya hlagala ka boyona, ka gona go rulaganywa gape ga disele tša T sebakeng sa peritoneal ga go molaleng. Go oketša moo, diphapano tše bohlokwa le go se swane magareng ga ascites le di- metabolite tšeo di lego gona tikologong ya hlagala di ka šitiša go tsenelela ga disele tša masole a mmele le go šoma ga tšona dihlagala, gomme go nyakega nyakišišo e oketšegilego.
E le gore re rarolle mathata a, re ile ra hlama mokgwa wa karoganyo ya disele ye e nago le kwelobohloko le mokgwa wa chromatography ya seela tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) go ithuta mehuta ye e fapanego ya disele (go akaretšwa disele tša CD4 + le CD8 + T) gammogo le ka gare le magareng ga dihlagala Dimetabolite tša yona di span disele ka tikologong ye e swanago ya ascites le hlagala ya molwetši. Re šomiša mokgwa wo ka kopanelo le cytometry ya go ela ya mahlakore a godimo le tatelano ya RNA ya sele e tee (scRNA-seq) go fa seswantšho se se rarolotšwego kudu sa maemo a metaboliki a baagi ba ba bohlokwa. Mokgwa wo o utollotše koketšego ye kgolo ya maemo a 1-methylnicotinamide (MNA) ka diseleng tša T tša hlagala, gomme diteko tša ka gare ga vitro di bontšhitše gore khuetšo ya immunomodulatory ya MNA go mošomo wa disele tša T e be e sa tsebje pele. Ka kakaretšo, mokgwa wo o utolla ditirišano tša metaboliki tša bobedi magareng ga dihlagala le disele tša masole a mmele, gomme o fa temogo ya moswananoši ka ga dimetabolite tša taolo ya masole a mmele, tšeo di ka bago le mohola bakeng sa kalafo ya kalafo ya masole a mmele a kankere ya mae ao a theilwego go disele tša T Menyetla ya Kalafo.
Re ile ra sebelisa phahameng-tlhakore phallo cytometry ho ka nako e le nngwe quantify glucose uptake [2- (N- (7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl) amino) -2-deoxyglucose (2-NBDG) le mitochondrial mosebetsi [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) ba lehlakoreng le lehlakoreng tlwaelehileng maswao ao a fapantšhago disele tša boitshireletšo bja mmele le baagi ba disele tša hlagala (Table S2 le Figure S1A). Tshekatsheko ye e bontšhitše gore ge e bapetšwa le disele tša T, ascites le disele tša hlagala di na le maemo a godimo a go tšea glucose, eupša di na le diphapano tše nnyane mošomong wa mitochondrial. Palogare ya go tšewa ga glucose ya disele tša hlagala [CD45-EpCAM (EpCAM)+] e feta ya disele tša T ka makga a mararo go ya go a mane, gomme palogare ya go tšewa ga glucose ya disele tša CD4 + T ke makga a 1.2 go feta a disele tša CD8 + T, e lego seo se bontšhago gore Di-lymphocyte tše di tsenelelago tša Hlagala (TIL) di na le dinyakwa tše di fapanego tša metaboliki gaešita le ka TME e swanago (Setshwantšho 1A). Ka go fapana, mošomo wa mitochondrial ka diseleng tša hlagala o swana le wa disele tša CD4 + T, gomme mošomo wa mitochondrial wa mehuta ye ka bobedi ya disele o godimo go feta wa disele tša CD8 + T (Setshwantšho 1B). Ka kakaretšo, dipoelo tše di utolla maemo a metaboliki. Mošomo wa metaboliki wa disele tša hlagala o godimo go feta wa disele tša CD4 + T, gomme mošomo wa metaboliki wa disele tša CD4 + T o godimo go feta wa disele tša CD8 + T. Go sa šetšwe ditlamorago tše go ralala le mehuta ya disele, ga go na phapano ye e sa fetogego maemong a metaboliki a disele tša CD4 + le CD8 + T goba dikarolo tša tšona tša go lekana ka go ascites ge di bapetšwa le dihlagala (Setshwantšho 1C). Ka go fapana, ka karolwaneng ya disele tša CD45, karolo ya disele tša EpCAM + ka gare ga hlagala e oketšegile ge e bapetšwa le ascites (Setshwantšho 1D). Re ile ra bona gape phapano ye e kwagalago ya metaboliki magareng ga dikarolo tša disele tša EpCAM + le EpCAM-. EpCAM + (hlahala) lisele tse na le phahameng glucose uptake le mitochondrial mosebetsi ho feta EpCAM- lisele tse, e leng phahameng haholo ho feta metaboliki mosebetsi oa fibroblasts ka lisele tse hlahala ka TME (Figure 1, E le F).
. (C) Tekanyo ya disele tša CD4 + le CD8 + (ya disele tša CD3 + T) ka gare ga ascites le hlagala. (D) Karolo ya disele tša hlagala tša EpCAM + ka gare ga ascites le hlagala (CD45−). (E le F) EpCAM + CD45-hlahala le EpCAM-CD45-matrix glucose uptake (2-NBDG) (E) le mitochondrial mosebetsi (MitoTracker lefifi khubelu) (F) moemeli dikerafo (ka letšehali) le ya data tabulated ( Tokelo ya) Ascites le lisele tsa hlahala. (G) Dikerafo tša baemedi ba polelo ya CD25, CD137 le PD1 ka cytometry ya go ela. (H le I) CD25, CD137 le PD1 polelo ka CD4 + T disele (H) le CD8 + T disele (I). (J le K) Naive, memoring ya bohareng (Tcm), effector (Teff) le effector memoring ya (Tem) phenotypes thehiloeng polelo ea CCR7 le CD45RO. Diswantšho tša moemedi (ka go le letshadi) le datha ya tafola (ka go le letona) ya disele tša CD4 + T (J) le disele tša CD8 + T (K) ka gare ga ascites le dihlagala. Ditekanyetšo tša P tšeo di beilwego ka teko ya t yeo e kopantšwego (* P <0.05, ** P <0.01 le *** P <0.001). Mola o emela balwetši bao ba swanago (n = 6). FMO, fluorescence tlosa e mong; MFI, mahareng fluorescence matla.
Tshekatsheko ye nngwe e utollotše diphapano tše dingwe tše bohlokwa magareng ga maemo a phenotypic a sele ya T ao a rarolotšwego kudu. The kenya tshebetsong (Figure 1, G ho I) le effector memoring ya (Figure 1, J le K) ka lihlahala ba haholo ho feta ascites (karolo ya CD3 + T lisele tse). Ka mo go swanago, go sekaseka phenotype ka polelo ya maswao a go tsenya tirišong (CD25 le CD137) le maswao a go fokotšega [proteine ​​ya lehu la sele ye e rulagantšwego 1 (PD1)] go bontšhitše gore le ge dimelo tša metaboliki tša baagi ba di fapane (Setshwantšho S1, B go ya go E) , Eupša ga go na diphapano tše bohlokwa tša metaboliki tšeo di ilego tša bonwa ka go se fetoge magareng ga dihlopha tše nnyane tša go hloka tlhaologanyo, tša effector goba tša go gopola (Setshwantšho S1, F go ya go I). Dipoelo tše di ile tša tiišetšwa ka go šomiša mekgwa ya go ithuta ka motšhene go abela ka go itiriša diphenotypes tša disele (21), tšeo di utollotšego gape go ba gona ga palo ye kgolo ya disele tša moko wa marapo (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ka gare ga ascites ya molwetši (Setshwantšho S2A ). Gare ga mehuta ka moka ya disele ye e lemogilwego, palo ye ya disele tša myeloid e bontšhitše go tšewa ga glucose ye e phagamego kudu le mošomo wa mitochondrial (Setshwantšho S2, B go ya go G). Dipoelo tše di laetša diphapano tše maatla tša metaboliki magareng ga mehuta ye mentši ya disele tšeo di hwetšwago ka go ascites le dihlagala go balwetši ba HGSC.
Tlhohlo ye kgolo ya go kwešiša dimelo tša metaboliki tša TIL ke tlhokego ya go arola dišupommu tša disele tša T tša bohlweki bjo bo lekanego, boleng le bontši go tšwa go dihlagala. Dinyakišišo tša morago bjale di bontšhitše gore mekgwa ya go hlopha le ya go humiša dipheta yeo e theilwego godimo ga cytometry ya go ela e ka lebiša go diphetogo tša diprofaele tša metabolite ya disele ( 22-24 ). Go fenya bothata bjo, re ile ra optimized mokgwa wa go humiša dipheta go arola le go arola TIL go tšwa go kankere ya mae a dikgogo a batho yeo e kgaotšwego ka go buiwa pele ga tshekatsheko ka LC-MS / MS (bona Didirišwa le Mekgwa; Seswantšho 2A). Gore re kgone go sekaseka khuetšo ya kakaretšo ya protocol ye go diphetogo tša metabolite, re ile ra bapetša diprofaele tša metabolite tša disele tša T tšeo di šomišitšwego ke baabi bao ba phetšego gabotse ka morago ga kgato ya karoganyo ya dipheta ye e lego ka mo godimo le disele tšeo di bego di sa aroganywa ka dipheta eupša di dutše godimo ga leqhwa. Tshekatsheko ye ya taolo ya boleng e hweditše gore go na le tswalano ye e phagamego magareng ga maemo a a mabedi (r = 0.77), gomme go boeletšwa ga setegeniki ga sehlopha sa dimetabolite tše 86 go na le go boeletšwa mo go phagamego (Setshwantšho 2B). Ka fao, mekgwa ye e ka dira tshekatsheko ya metabolite ye e nepagetšego ka diseleng tšeo di lego ka fase ga go humišwa ga mohuta wa sele, ka go realo ya fa sefala sa mathomo sa tharollo ya godimo sa go hlaola dimetabolite tše itšego ka go HGSC, ka go realo ya kgontšha batho go hwetša kwešišo ye e tseneletšego ya go kgethegile ga sele Lenaneo la metabolism ya thobalano.
(A) Schematic setšoantšo sa makenete dipheta khumo. Pele ga tshekatsheko ka LC-MS/MS, disele di tla feta ka gare ga dipotologo tše tharo tše di latelanago tša go humiša dipheta tša makenete goba tša dula di le leqhoeng. (B) Phello ya mohuta wa go humiša go bontši bja di-metabolite. Palogare ya dikelo tše tharo tša mohuta wo mongwe le wo mongwe wa go humiša ± SE. Mothaladi wo moputswa o emela kamano ya 1:1. Kamano ya ka gare ga sehlopha (ICC) ya dikelo tše di boeleditšwego tše di bontšhitšwego ka go leina la sele. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide ya go swana le yona. (C) Seswantšho sa sekema sa tshepedišo ya mošomo ya tshekatsheko ya metabolite ya balwetši. Ascites goba dihlagala di kgoboketšwa go tšwa go balwetši gomme di bolokwa ka cryopreserved. Karolo ye nnyane ya sampole ye nngwe le ye nngwe e ile ya sekasekwa ka flow cytometry, mola disampole tše di šetšego di ile tša dira dipotologo tše tharo tša go humiša bakeng sa disele tša CD4+, CD8+ le CD45-. Dikarolwana tše tša disele di ile tša hlahlobja ka go šomiša LC-MS/MS. (D) Mmapa wa phišo wa bontši bja metabolite bjo bo tlwaelegilego. Dendrogram e emela go kgoboketšwa ga Ward ga bokgole bja Euclidean magareng ga dišupommu. (E) Tshekatsheko ya karolo ye kgolo (PCA) ya mmapa wa metabolite ya mohlala, yeo e bontšhago diphetolelo tše tharo tša sampole ye nngwe le ye nngwe, disampole go tšwa go molwetši o tee di kgokagantšwe ka mola. (F) The PCA ya profil metabolite ya sampole conditioned ka mokuli (ke gore, sebelisa karolo redundancy); mofuta wa sampole o lekanyeditswe ke sekepe sa convex. PC1, karolo e ka sehloohong 1; PC2, karolo e ka sehloohong 2.
Se se latelago, re dirišitše mokgwa wo wa go humiša go sekaseka dimetabolite tše 99 ka dikarolwaneng tša disele tša CD4 +, CD8 + le CD45 ka gare ga ascites ya mathomo le dihlagala tša balwetši ba tshela ba HGSC ( Seswantšho 2C, Seswantšho S3A le Lenaneo la S3 le S4). Palo ya batho ya kgahlego e tšea 2% go ya go 70% ya sampole ye kgolo ya mathomo ya disele tše di phelago, gomme karolo ya disele e fapana kudu magareng ga balwetši. Ka morago ga go aroganya dipheta, karolwana ye e humišitšwego ya kgahlego (CD4+, CD8+ goba CD45-) e tšea go feta 85% ya disele ka moka tše di phelago mo sampoleng ka palogare. Mokgwa wo wa go humiša o re dumelela go sekaseka palo ya disele go tšwa go metabolism ya dinama tša hlagala tša batho, e lego seo se sa kgonegego go se dira go tšwa go disampole tše kgolo. Ka go diriša protocol ye, re ile ra phetha ka gore l-kynurenine le adenosine, di-metabolite tše tše pedi tšeo di hlaotšwego gabotse tša immunosuppressive di be di phagamišitšwe ka diseleng tša T tša hlagala goba disele tša hlagala ( Seswantšho S3 , B le C ). Ka fao, dipoelo tše di bontšha potego le bokgoni bja theknolotši ya rena ya karoganyo ya disele le ya mass spectrometry go hwetša dimetabolite tše bohlokwa tša thutaphedi ka gare ga ditlhalenama tša balwetši.
Tshekatsheko ya rena e utollotše gape karoganyo ye maatla ya metaboliki ya mehuta ya disele ka gare le magareng ga balwetši ( Seswantšho 2D le Seswantšho S4A ). Ka mo go kgethegilego, ge go bapetšwa le balwetši ba bangwe, molwetši wa 70 o bontšhitše dimelo tše di fapanego tša metaboliki (Setshwantšho 2E le Seswantšho S4B), e lego seo se bontšhago gore go ka ba le go se swane mo gogolo ga metaboliki magareng ga balwetši. Ke mo go swanetšego go lemoga gore ge go bapetšwa le balwetši ba bangwe (dilitara tše 1.2 go ya go tše 2; Lenaneo la S1), palomoka ya ascites yeo e kgobokeditšwego go balwetši ba 70 (80 ml) e be e le ye nnyane. Taolo ya heterogeneity magareng ga balwetši nakong ya tshekatsheko ya dikarolo tše kgolo (mohlala, go šomiša tshekatsheko ya redundancy ya karolo) e bontšha diphetogo tše di sa fetogego magareng ga mehuta ya disele, gomme mehuta ya disele le / goba microenvironment di kgobokeditšwe ka mo go kwagalago go ya ka profil ya metabolite (Figure 2F ). Tshekatsheko ya di-metabolite tše tee e ile ya gatelela ditlamorago tše gomme ya utolla diphapano tše kgolo magareng ga mehuta ya disele le tikologo ye nnyane. Go bohlokwa go lemoga gore phapano ye e feteletšego kudu ye e hlokometšwego ke MNA, yeo gantši e humišitšwego ka diseleng tša CD45- le ka diseleng tša CD4+ le CD8+ tšeo di tsenago ka gare ga hlagala (Setshwantšho 3A). Go disele tša CD4 +, khuetšo ye e bonagala kudu, gomme MNA ka diseleng tša CD8 + le yona e bonala e amega kudu ke tikologo. Le ge go le bjalo, se ga se bohlokwa, ka gobane ke balwetši ba bararo fela go ba tshela bao ba ka hlahlobjago bakeng sa dintlha tša CD8+ tša hlagala. Go tlaleletša go MNA, ka mehuta ye e fapanego ya disele ka gare ga ascites le dihlagala, dimetabolite tše dingwe tšeo di sa hlaolwago gabotse ka go TIL le tšona di humile ka go fapana (Ditshwantšho S3 le S4). Ka fao, ya data ye e utolla sete ye e holofetšago ya dimetabolite tša immunomodulatory bakeng sa dinyakišišo tše dingwe.
(A) Diteng tše di tlwaelegilego tša MNA ka gare ga disele tša CD4+, CD8+ le CD45- go tšwa go ascites le hlagala. Ploto ya lepokisi e bontšha magareng (mola), lefelo la magareng ga dikotara (hinge ya foreime) le lefelo la datha, go fihla go makga a 1.5 a legoro la magareng ga dikotara (lešoba la foreime). Bjalo ka ge go hlalošitšwe go Didirišwa le Mekgwa ya Molwetši, šomiša boleng bja limma bja molwetši go bona boleng bja P (* P <0.05 le ** P <0.01). (B) Sekema setšoantšo sa MNA metabolism (60). Diphetogo tša go fetoga: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine ​​ya go dira dilo; NA, nikotinamide ya; MNA, 1-m e l i n i k o t i n a m i d; 2-PY, 1-methyl- 2-pyridone-5-khaboksamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-khaboksamid; NR, ribose ya nikotinamide; NMN, nicotinamide ya mononucleotide. Di-enzyme (tše tala): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, di- sirtuin, e lego di- sirtuin; NAMPT, nikotinamide ya fosforibosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1, e lego 1; NRK, nikotinamide ya riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nyukleothaete adenylate transferase; Pnp1, purine nyukleoside phosphorylase. (C) t-SNE ya scRNA-seq ya ascites (bohlooho) le hlahala (khubelu; n = 3 bakuli). (D) NNMT polelo ka baagi ba disele tše di fapanego tšeo di hlaotšwego ka go šomiša scRNA-seq. (E) Polelo ya NNMT le AOX1 ka SK-OV-3, dipshio tša embryo tša motho (HEK) 293T, disele tša T le disele tša T tšeo di alafilwego ka MNA. Polelo ya go phuthwa e bontšhwa ge e bapetšwa le SK-OV-3. The polelo mohlala le SEM e bontšitsoe (n = 6 bophelo bo botle baabi). Ditekanyetšo tša Ct tše di fetago 35 di tšewa e le tšeo di sa lemogegego (UD). (F) Polelo ya SLC22A1 le SLC22A2 ka SK-OV-3, HEK293T, disele tša T le disele tša T tšeo di alafilwego ka 8mM MNA. Polelo ya go phuthwa e bontšhwa ge e bapetšwa le SK-OV-3. The polelo mohlala le SEM e bontšitsoe (n = 6 bophelo bo botle baabi). Ditekanyetšo tša Ct tše di fetago 35 di tšewa e le tšeo di sa lemogegego (UD). (G) Diteng tša MNA ya sele ka diseleng tša T tša moabi tše di phetšego gabotse tše di šomišitšwego ka morago ga diiri tše 72 tša go duša ka MNA. The polelo mohlala le SEM e bontšitsoe (n = 4 bophelo bo botle baabi).
MNA e tšweletšwa ka go fetišetša sehlopha sa methyl go tšwa go S-adenosyl-1-methionine (SAM) go ya go nicotinamide (NA) ka nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Seswantšho 3B). NNMT e bontšhwa ka mo go feteletšego ka dikankere tše di fapafapanego tša batho gomme e tswalanywa le go ata, tlhaselo le metastasis ( 25-27 ). Go kwešiša gakaone mohlodi wa MNA ka diseleng tša T ka go TME, re šomišitše scRNA-seq go hlaola polelo ya NNMT go ralala le mehuta ya disele ka gare ga ascites le dihlagala tša balwetši ba bararo ba HGSC (Table S5). Tshekatsheko ya disele tše ka bago 6,500 e bontšhitše gore ka ditikologong tša ascites le hlagala, polelo ya NNMT e be e lekanyeditšwe go baagi bao go akanyetšwago gore ba fibroblast le disele tša hlagala (Setshwantšho 3, C le D). Go bohlokwa go lemoga gore ga go na polelo ye e lego molaleng ya NNMT mo setšhabeng sefe goba sefe seo se bontšhago PTPRC (CD45 +) (Setshwantšho 3D le Seswantšho S5A), seo se laetšago gore MNA yeo e lemogilwego ka sepektheremong sa metabolite e tsentšwe ka gare ga disele tša T. Polelo ya aldehyde oxidase 1 (AOX1) e fetolela MNA go 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) goba 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4- PYR); Seswantšho 3B) e bile e lekanyeditšwe go palo ya di-fibroblast tšeo di bontšhago COL1A1 (Setshwantšho S5A), tšeo mmogo di bontšhago gore disele tša T di hloka bokgoni bja metabolism ya MNA ye e tlwaelegilego. Mohlala wa polelo ya dikarolwana tše tša leabela tše di amanago le MNA o ile wa netefatšwa ka go šomiša sete ya data ya sele ya bobedi ye e ikemetšego go tšwa go ascites go tšwa go balwetši ba HGSC (Figure S5B; n = 6) (16). Go tlaleletša, tshekatsheko ya karabelo ya ketane ya polymerase ya boleng (qPCR) ya disele tša T tša moabi tše di phetšego gabotse tšeo di alafilwego ka MNA e bontšhitše gore ge e bapetšwa le disele tša hlagala ya mae a dikgogo tša taolo ya SK-OV-3, NNMT goba AOX1 e be e nyakile e sa bontšhwa ( Seswantšho 3E ). Dipoelo tše tše di sa letelwago di bontšha gore MNA e ka ntšhwa go tšwa go di-fibroblast goba dihlagala go ya diseleng tša T tšeo di bapilego le tšona ka go TME.
Le ge bonkgetheng ba akaretša lapa la dinamelwa tša cation tša organic 1 go ya go 3 (OCT1, OCT2 le OCT3) tšeo di ngwadilwego ka khoutu ke lapa la mojari wa go qhibidiga 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 le SLC22A3), dinamelwa tšeo di ka bago gona tša MNA di sa dutše di sa hlalošwa (28) . QPCR ya mRNA go tšwa go disele tša T tša moabi tše di phetšego gabotse e bontšhitše maemo a tlase a polelo ya SLC22A1 eupša maemo a sa lemogegego a SLC22A2, ao a tiišeditšego gore e begilwe peleng ka dingwalweng ( Seswantšho 3F ) ( 29 ). Ka go fapana, mola wa sele ya hlagala ya mae a dikgogo ya SK-OV-3 o bontšhitše maemo a godimo a dinamelwa ka bobedi ( Seswantšho 3F ).
Gore go kgonege go leka kgonagalo ya gore disele tša T di be le bokgoni bja go monya MNA ya dinaga dišele, disele tša T tša moabi tše di phetšego gabotse di ile tša godišwa ka diiri tše 72 ka go ba gona ga ditekanyetšo tše di fapanego tša MNA. Ka go se be gona ga MNA ya ka ntle, diteng tša sele tša MNA di ka se lemogwe (Setshwantšho 3G). Le ge go le bjalo, disele tša T tše di šomišitšwego tšeo di alafilwego ka MNA ya ka ntle di bontšhitše koketšego ye e ithekgilego ka tekanyo ya diteng tša MNA ka diseleng, go fihla go 6 mM MNA ( Seswantšho 3G ). Sephetho se se laetša gore go sa šetšwe maemo a fase a polelo ya senamelwa le go hloka ensaeme ye kgolo yeo e ikarabelago ka metabolism ya MNA ya ka gare ga sele, TIL e sa kgona go tšea MNA.
Sepektheramo sa di- metabolite ka diseleng tša T tša balwetši le diteko tša go monya MNA ka gare ga vitro di oketša kgonagalo ya gore di-fibroblast tšeo di sepedišanago le kankere (CAF) di ntšha MNA gomme disele tša hlagala di ka laola phenotype le mošomo wa TIL. Go bona mafelelo a MNA go disele tša T, disele tša T tša baabi tše di phetšego gabotse di ile tša šomišwa ka vitro ka go ba gona goba go se be gona ga MNA, gomme go ata ga tšona le tšweletšo ya cytokine di ile tša hlahlobja. Ka morago ga matšatši a 7 a go oketša MNA ka tekanyo e phagamego kudu, palo ya go ipoeletša gabedi ya baagi e ile ya fokotšwa ka tekanyo e lekanetšego, mola matla a ile a bolokwa ka ditekanyo ka moka (Setshwantšho 4A). Go tlaleletša, kalafo ya MNA ya ka ntle e feleleditše ka koketšego ya karolo ya disele tša CD4 + le CD8 + T tšeo di bontšhago tumor necrosis factor-α (TNFα; Seswantšho 4B). Ka go fapana, tšweletšo ya ka gare ga sele ya IFN-γ e ile ya fokotšwa kudu ka diseleng tša CD4 + T, eupša e sego ka diseleng tša CD8 + T, gomme go be go se na phetogo ye kgolo go interleukin 2 (IL-2; Seswantšho 4, C le D). Ka fao, tshekatsheko ya immunosorbent yeo e kgokagantšwego le ensaeme (ELISA) ya di-supernatant go tšwa go ditšo tše tša disele tša T tšeo di alafilwego ka MNA e bontšhitše koketšego ye kgolo ya TNFα, go fokotšega ga IFN-γ, le go se be le phetogo ya IL-2 (Setshwantšho 4, E go ya go G). . Go fokotšega ga IFN-γ go laetša gore MNA e ka kgatha tema go thibela mošomo wa go lwantšha hlagala wa disele tša T. E le gore go ekišwe mafelelo a MNA go cytotoxicity yeo e tsenywago gare ke disele tša T, disele tša chimeric antigen receptor T (FRα-CAR-T) tšeo di nepišago disele tša folate receptor α le CAR-T (GFP) tšeo di laolwago ke disele tša proteine ​​ye tala ya fluorescent (GFP) -CAR-T) di tšweletšwa ke disele tša mononuclear tša madi a pheriferale ya moabi tše di phetšego gabotse (PBMC). Disele tša CAR-T di ile tša godišwa ka diiri tše 24 ka go ba gona ga MNA, gomme ka morago tša godišwa mmogo le disele tša hlagala tša mae a dikgogo tša batho SK-OV-3 tšeo di bontšhago folate receptor α ka tekanyo ya effector go ya go nepišo ya 10:1. Kalafo ya MNA e feleleditše ka go fokotšega mo gogolo ga mošomo wa go bolaya wa disele tša FRα-CAR-T, tšeo di bego di swana le disele tša FRα-CAR-T tšeo di alafilwego ka adenosine ( Seswantšho 4H ).
(A) Palomoka ya palo ya disele tše di šomago le go ipoeletša ga baagi (PD) thwii go tšwa setšong ka letšatši la 7. Kerafo ya dibara e emela magareng + SEM ya baabi ba tshela bao ba phetšego gabotse. Emela ya data go tšwa go bonyane n = 3 diteko tše di ikemetšego. (B go ya go D) CD3/CD28 le IL-2 di ile tša šomišwa go dira gore disele tša T di šome ka ditekanyetšo tša tšona tša MNA ka go latelana ka matšatši a 7. Pele ga tshekatsheko, disele di ile tša hlohleletšwa ka PMA / ionomycin ka GolgiStop ka diiri tše 4. TNFα (B) polelo ka diseleng T. Mohlala seswantšho (ka go le letshadi) le ya data ya tafola (ka go le letona) ya polelo ya TNFα ka diseleng tše di phelago. IFN-γ (C) le IL-2 (D) polelo ka diseleng T. Polelo ya di-cytokines e ile ya lekantšhwa ka cytometry ya go ela. Kerafo ya dibara e emela magareng (n = 6 baabi ba phetšego gabotse) + SEM. Šomiša tshekatsheko ya tsela e tee ya phapano le dikelo tše di boeletšwago (* P <0.05 le ** P <0.01) go laetša boleng bja P. Emela ya data ho tloha bonyane n = 3 liteko ikemetseng. (E go ya go G) CD3/CD28 le IL-2 di ile tša šomišwa go dira gore disele tša T di šome ka ditekanyetšo tša tšona tša MNA ka go latelana ka matšatši a 7. Segare se ile sa kgoboketšwa pele le ka morago ga diiri tše 4 tša go hlohleletša ga PMA/ionomycin. Ditekanyetšo tša TNFα (E), IFN-γ (F) le IL-2 (G) di ile tša lekantšhwa ka ELISA. Kerafo ya dibara e emela magareng (n = 5 baabi ba phetšego gabotse) + SEM. P boleng ikemiselitse sebelisa tsela e le 'ngoe and analysis ya phapang le ditekanyo pheta-pheta (* P <0.05). Mola wa marontho o bontšha moedi wa go utolla wa go utolla. (H) Teko ya lysis ya disele. FRα-CAR-T goba GFP-CAR-T disele di ile tša beakanywa ka adenosine (250μM) goba MNA (10 mM) ka diiri tše 24, goba tša tlogelwa di sa alafše (Ctrl). Peresente ya polao ya disele tša SK-OV-3 e ile ya lekantšhwa. P boleng ikemiseditse ka Welch t teko (* P <0.5 le ** P <0.01).
E le gore go hwetšwe kwešišo ya motšhene ya taolo ya polelo ya TNFα yeo e ithekgilego ka MNA, diphetogo tša TNFα mRNA ya disele tša T tšeo di alafilwego ka MNA di ile tša hlahlobja ( Seswantšho 5A ). Disele tša T tša moabi tše di phetšego gabotse tšeo di alafilwego ka MNA di bontšhitše koketšego ya makga a mabedi ya maemo a go ngwalolla TNFα, e lego seo se bontšhago gore MNA e ithekgile ka taolo ya go ngwalolla ya TNFα. Go nyakišiša mokgwa wo wa taolo wo o kgonegago, mabaka a mabedi a tsebjago a go ngwalolla ao a laolago TNFα, e lego Ntlha ya nuclear ya sele ya T yeo e šomišitšwego (NFAT) le protheine ye e itšego 1 (Sp1), di ile tša hlahlobja go arabela go tlama ga MNA go motšweletši wa TNFα wa kgauswi ( 30 ). Mohlohleletši wa TNFα o na le mafelo a 6 a go tlama a NFAT ao a hlaotšwego le mafelo a 2 a go tlama a Sp1, a lekelelana lefelong le tee [-55 dipara tša motheo (bp) go tšwa go 5'cap] (30). Chromatin immunoprecipitation (ChIP) e bontšhitše gore ge e alafša ka MNA, go tlama ga Sp1 go motšweletši wa TNFα go oketšegile ka makga a mararo. Go tsenywa ga NFAT le gona go oketšegile gomme gwa batamela bohlokwa (Setshwantšho 5B). ya data tsena bontša hore MNA laola polelo ea TNFα ka Sp1 transcription, le ka tekanyo e nyenyane polelo ea NFAT.
(A) Ge go bapetšwa le disele tša T tšeo di godišitšwego ntle le MNA, phetogo ya go mena ya polelo ya TNFα ka diseleng tša T tšeo di alafilwego ka MNA. The polelo mohlala le SEM e bontšitsoe (n = 5 bophelo bo botle baabi). Emela ya data ho tloha bonyane n = 3 liteko ikemetseng. (B) Mohlohleletši wa TNFα wa disele tša T tšeo di alafilwego ka goba ntle le 8 mM MNA ka morago ga NFAT le Sp1 di ile tša kopanywa le (Ctrl) le tlhohleletšo ya PMA/ionomycin ka diiri tše 4. Immunoglobulin G (IgG) le H3 di ile tša šomišwa bjalo ka taolo ye mpe le ye botse ya immunoprecipitation, ka go latelelana. Go lekanyetša boleng bja ChIP go bontšhitše gore go tlama ga Sp1 le NFAT go motšweletši wa TNFα ka diseleng tšeo di alafilwego ka MNA go oketšegile ka makga a mmalwa ge go bapetšwa le taolo. Emela ya data ho tloha bonyane n = 3 liteko ikemetseng. P boleng ikemiseditse ke multiple t-teko (*** P <0.01). (C) Ge go bapetšwa le ascites ya HGSC, disele tša T (tšeo e sego tša cytotoxic) di bontšhitše polelo ye e oketšegilego ya TNF ka gare ga hlagala. Mebala e emela bakuli ba fapaneng. Disele tše di bontšhitšwego di tšerwe sampole ka go se kgethe go fihla go 300 gomme tša jittered go lekanyetša go goga go feta tekano (** Padj = 0.0076). (D) Mohlala o šišintšwego wa MNA bakeng sa kankere ya mae a dikgogo. MNA e tšweletšwa ka diseleng tša hlagala le di-fibroblast ka go TME gomme e tšewa ke disele tša T. MNA e oketša go tlama ga Sp1 go motšweletši wa TNFα, go lebiša go go oketšega ga go ngwalollwa ga TNFα le tšweletšo ya cytokine ya TNFα. MNA gape e baka go fokotšega ga IFN-γ. Thibelo ya mošomo wa disele tša T e lebiša go fokotšegeng ga bokgoni bja go bolaya le go akgofiša kgolo ya hlagala.
Go ya ka dipego, TNFα e na le ditlamorago tša go lwantšha hlagala le tša go lwantšha hlagala tšeo di ithekgilego ka pele le ka morago, eupša e na le tema ye e tsebegago ya go kgothaletša kgolo le metastasis ya kankere ya mae a dikgogo ( 31-33 ). Go ya ka dipego, tekanyo ya TNFα ka gare ga ascites le ditlhalenama tša hlagala go balwetši bao ba nago le kankere ya mae a dikgogo e phagame go feta yeo e lego ditlhalenama tše di sa tšhošetšego ( 34-36 ). Mabapi le mokgwa, TNFα ka laola kenya tshebetsong, mosebetsi le ho ata ha lisele tse tšoeu mali, le fetola phenotype ea lisele tse kankere ( 37 , 38 ). Go sepelelana le diphetho tše, tshekatsheko ya polelo ya dikarolwana tša leabela tša phapano e bontšhitše gore TNF e be e laolwa godimo kudu ka diseleng tša T ka gare ga dinama tša hlagala ge e bapetšwa le ascites ( Seswantšho 5C ). Koketšego ya polelo ya TNF e be e bonagala fela ka go baagi ba disele tša T ka phenotype yeo e sego ya cytotoxic ( Seswantšho S5A ). Ka boripana, ya data ye e thekga kgopolo ya gore MNA e na le ditlamorago tše pedi tša go gatelela masole a mmele le tša go godiša hlagala ka go HGSC.
Go swaya ka fluorescent mo go theilwego godimo ga flow cytometry e fetogile mokgwa wo mogolo wa go ithuta metabolism ya TIL. Dinyakišišo tše di bontšhitše gore ge di bapetšwa le di-lymphocyte tša madi a pheriferale goba disele tša T go tšwa ditho tša bobedi tša lymphoid, TIL ya murine le ya motho e na le tshekamelo e phagamego ya go tšea glucose ( 4 , 39 ) le tahlegelo ya ganyenyane-ganyenyane ya mošomo wa mitochondrial ( 19 , 40 ). Le ge re lemogile dipoelo tše di swanago thutong ye, tlhabollo ya bohlokwa ke go bapetša metabolism ya disele tša hlagala le TIL go tšwa go dinama tše di swanago tša hlagala tšeo di kgaotšwego. Go sepelelana le tše dingwe tša dipego tše tša peleng, disele tša hlagala (CD45-EpCAM +) go tšwa go ascites le dihlagala di na le go tšewa ga glucose mo go phagamego go feta disele tša CD8 + le CD4 + T, e lego seo se thekgago gore go tšewa ga glucose mo go phagamego ga disele tša hlagala go ka bapetšwa le disele tša T. Kgopolo ya go phadišano ya disele tša T. TME. Le ge go le bjalo, mošomo wa mitochondrial wa disele tša hlagala o godimo go feta wa disele tša CD8 + T, eupša mošomo wa mitochondrial o swana le wa disele tša CD4 + T. Dipoelo tše di tiiša sehlogo se se tšwelelago sa gore metabolism ya oxidative e bohlokwa go disele tša hlagala ( 41 , 42 ). Ba šišinya gape gore disele tša CD8 + T di ka ba kotsing kudu ya go se šome gabotse ga oxidative go feta disele tša CD4 + T, goba gore disele tša CD4 + T di ka šomiša methopo ya khapone ntle le glucose go boloka mošomo wa mitochondrial ( 43 , 44 ). Go swanetše go lemogwa gore ga se ra bona phapano ka go tšewa ga glucose goba mošomo wa mitochondrial magareng ga di-CD4 + T effectors, T effector memory le disele tša T central memory ka go ascites. Ka mo go swanago, boemo bja phapano bja disele tša CD8 + T ka dihlagala ga bo amane le diphetogo tša go tšewa ga glucose, e gatelela phapano ye kgolo magareng ga disele tša T tšeo di godišitšwego ka gare ga vitro le TIL ya motho ka vivo ( 22 ). Ditebelelô tše di ile tša tiišetšwa gape ke tšhomišo ya kabo ya palo ya disele ya go itiriša ye e sa tšeego lehlakore, yeo e utollotšego gape gore disele tša CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + tšeo di nago le go tšewa ga glucose ye e phagamego le mošomo wa mitochondrial go feta disele tša hlagala di atile eupša di na le palo ya disele tše di šomago tša Metabolic. Palo ye e ka emela subpopulation yeo e akanyetšwago ya disele tša myeloid suppressor goba disele tša plasmacytoid dendritic tšeo di lemogilwego ka tshekatshekong ya scRNA-seq. Le ge tše ka bobedi di begilwe ka dihlagala tša mae a dikgogo tša batho [45], di sa nyaka Mošomo wo mongwe ke go hlaloša subpopulation ye ya myeloid.
Le ge e le gore mekgwa ye e theilwego godimo ga cytometry ya go ela e ka hlakiša diphapano tša kakaretšo tša glucose le metabolism ya oxidative magareng ga mehuta ya disele, dimetabolite tše di nepagetšego tšeo di tšweleditšwego ke glucose goba methopo ye mengwe ya khapone bakeng sa metabolism ya mitochondrial ka go TME ga se tša hlwa di laolwa. Go abela go ba gona goba go se be gona ga dimetabolite go sehlopha se senyenyane sa TIL se se filwego go nyaka tlhwekišo ya palo ya disele go tšwa go dinama tše di kgaotšwego. Ka fao, mokgwa wa rena wa go humiša disele wo o kopantšwego le spectrometry ya boima o ka fa temogo ka ga dimetabolite tšeo di humišitšwego ka go fapana ka diseleng tša T le baagi ba disele tša hlagala ka go swana ga disampole tša balwetši. Le ge mokgwa wo o na le mehola go feta go hlopha disele tšeo di šomišitšwego ka fluorescence, makgobapuku a itšego a metabolite a ka amega ka lebaka la go tsepama ga tlhago le / goba seelo sa phetogo ya ka pela ( 22 ). Le ge go le bjalo, mokgwa wa rena o kgonne go hlaola dimetabolite tše pedi tše di lemogilwego tša go gatelela masole a mmele, adenosine le kynurenine, ka lebaka la gore di fapana kudu magareng ga mehuta ya sampole.
Tshekatsheko ya rena ya metabolite ya dihlagala le mehuta ya ka fasana ya TIL e fa temogo ye ntši ka ga tema ya dimetabolite ka go TME ya mae a dikgogo. Sa mathomo, ka go šomiša flow cytometry, re ile ra bona gore ga go na phapano mošomong wa mitochondrial magareng ga dihlagala le disele tša CD4 + T. Le ge go le bjalo, tshekatsheko ya LC-MS/MS e utollotše diphetogo tše kgolo ka bontši bja dimetabolite gare ga baagi ba, e laetša gore diphetho mabapi le metabolism ya TIL le mošomo wa yona wa metaboliki ka kakaretšo di nyaka tlhathollo ye e hlokometšwego. Sa bobedi, MNA ke metabolite yeo e nago le phapano ye kgolo magareng ga disele tša CD45 le disele tša T ka go ascites, e sego dihlagala. Ka fao, compartmentalization le lefelo la hlagala di ka ba le ditlamorago tše di fapanego go metabolism ya TIL, yeo e gatelelago heterogeneity ye e kgonegago ka microenvironment ye e filwego. Sa boraro, polelo ya ensaeme yeo e tšweletšago MNA NNMT e lekanyeditšwe kudu go CAF, yeo e lego disele tša hlagala ka tekanyo e nyenyane, eupša maemo a MNA ao a lemogegago a bonwa ka diseleng tša T tšeo di tšwago go hlagala. The overexpression ya NNMT ka ovarian CAF na le tsejoang kankere-kgothaletsa phello, karolo e nngwe ka lebaka la kgothaletso ya CAF metabolism, hlahala tlhaselo le metastasis ( 27 ). Le ge e le gore maemo a kakaretšo a TIL a lekanetšego, polelo ya NNMT ka go CAF e amana kudu le mohuta wa ka fasana wa mesenchymal wa Cancer Genome Atlas (TCGA), yeo e amanago le ponelopele ye mpe ( 27 , 46 , 47 ). Mafelelong, polelo ya ensaeme ya AOX1 yeo e ikarabelago ka go senyega ga MNA le yona e lekanyeditšwe go palo ya CAF, yeo e laetšago gore disele tša T di hloka bokgoni bja go metabolize MNA. Dipoelo tše di thekga kgopolo ya gore le ge e le gore go nyakega mošomo wo mongwe go netefatša sephetho se, maemo a godimo a MNA ka diseleng tša T a ka laetša go ba gona ga microenvironment ya CAF yeo e gatelelago masole a mmele.
Ka lebaka la maemo a fase a polelo ya dinamelwa tša MNA le maemo ao a sa lemogegego a diproteine ​​tše bohlokwa tšeo di akaretšwago ka go metabolism ya MNA, go ba gona ga MNA ka diseleng tša T ga go letelwe. Ga go NNMT goba AOX1 yeo e bego e ka lemogwa ka tshekatsheko ya scRNA-seq le qPCR ye e nepišitšwego ya dihlopha tše pedi tše di ikemetšego. Dipoelo tše di laetša gore MNA ga e hlamelwe ke disele tša T, eupša e monywa go tšwa go TME ye e dikologilego. Diteko tša ka gare ga vitro di bontšha gore disele tša T di na le tshekamelo ya go kgoboketša MNA ya ka ntle.
Dinyakišišo tša rena tša ka gare ga vitro di bontšhitše gore MNA ya ka ntle e hlohleletša polelo ya TNFα ka diseleng tša T gomme e godiša go tlama ga Sp1 go motšweletši wa TNFα. Le ge TNFα e na le mešomo ya bobedi ya go lwantšha hlagala le ya go lwantšha hlagala, ka kankereng ya mae a dikgogo, TNFα e ka kgothaletša kgolo ya kankere ya mae a dikgogo ( 31-33 ). The neutralization ya TNFα ka ovarian hlahala sele setso kapa ho felisoa ha TNFα pontšo ka dikai toeba ka ntlafatsa TNFα-mediated inflammatory cytokine tlhahiso le thibela hlahala kgolo ( 32 , 35 ). Ka hona, tabeng ena, TME-e tswang MNA ka sebetsa e le pro-inflammatory metabolite ka TNFα-itšetlehile ka mokgwa wa ka autocrine lupu, ka tsela eo kgothaletsa ketsahalo le ho phatlalala ha kankere ea mae a dikgogo ( 31 ). Go ya ka kgonagalo ye, go thibelwa ga TNFα go ithutwa bjalo ka moemedi wa kalafo yo a ka bago gona bakeng sa kankere ya mae a dikgogo ( 37 , 48 , 49 ). Go tlaleletša, MNA e senya cytotoxicity ya disele tša CAR-T go disele tša hlagala ya mae a dikgogo, e fa bohlatse bjo bongwe bja go gatelela masole a mmele mo go tsenywago gare ke MNA. Ka kakaretšo, dipoelo tše di šišinya mohlala woo go wona dihlagala le disele tša CAF di ntšhago MNA ka gare ga TME ya ka ntle ga sele. Ka (i) TNF-hlohleletšwago mae a dikgogo kgolo ya tlhohleletšo le (ii) MNA-hlohleletsago T sele cytotoxic mosebetsi thibelo, sena se ka ba le habeli hlahala phello (Figure 5D).
Ge re phetha, ka go diriša motswako wa go humiša disele ka lebelo, tatelano ya sele e tee le go dira diprofaele tša metaboliki, nyakišišo ye e utollotše diphapano tše kgolo tša immunometabolomic magareng ga dihlagala le disele tša ascites go balwetši ba HGSC. Tshekatsheko ye e feletšego e bontšhitše gore go na le diphapano ka go tšewa ga glucose le mošomo wa mitochondrial magareng ga disele tša T, gomme e hlaotše MNA bjalo ka metabolite ya taolo ya masole a mmele yeo e sa ikemego ya disele. Datha ye e na le khuetšo go ka fao TME e amago metabolism ya disele tša T ka dikankere tša batho. Gaešita le ge phadišano e lebanyago ya phepo magareng ga disele tša T le disele tša kankere e begilwe, di- metabolite di ka šoma gape e le balaodi ba sa lebanyego bakeng sa go kgothaletša tšwelopele ya hlagala gomme mohlomongwe tša gatelela dikarabelo tša ka gare tša masole a mmele. Tlhaloso ye nngwe ya tema ya mošomo ya dimetabolite tše tša taolo e ka bula maano a mangwe a go godiša karabelo ya masole a mmele a kgahlanong le hlagala.
Dipeelano tša balwetši le ya data ya kliniki di hweditšwe ka polokelo ya dinama tša hlagala ya kankere ya BC yeo e netefaditšwego ke Canadian Tissue Repository Network. Go ya ka protocol yeo e dumeletšwego ke Komiti ya Boitshwaro ya Dinyakišišo tša Kankere ya BC le Yunibesithi ya British Columbia (H07-00463), dipeelano ka moka tša balwetši le ya data ya kliniki di hweditše tumelelo ye e ngwadilwego ye e nago le tsebo goba tša tlogela tumelelo ya bona semmušo. Disampole di bolokilwe ka gare ga BioBank ye e netefaditšwego (BRC-00290). Dika tša balwetši ka botlalo di bontšhitšwe go Dithebole S1 le S5. Bakeng sa cryopreservation, scalpel e dirišetšwa go bola ka motšhene sampole ya hlagala ya molwetši gomme ka morago e e kgoromeletše ka gare ga sefepi sa 100-micron bakeng sa go hwetša go emišwa ga sele e tee. Ascites ya molwetši e ile ya centrifuged ka 1500 rpm ka metsotso ye 10 ka 4°C go pellet disele le go tloša supernatant. Disele tše di hweditšwego go tšwa go hlagala le ascites di ile tša bolokwa ka cryopreserved ka gare ga 50% ya serum ya AB ya motho yeo e sa šomego ka phišo (Sigma-Aldrich), 40% ya RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) le 10% ya dimethyl sulfoxide. Difegišo tše tše di bolokilwego tša sele e tee di ile tša tološwa gomme tša šomišwa go metabolomics le boikemišetšo bja metabolite bjo bo hlalošitšwego ka mo tlase.
Segare se se feletšego se na le 0.22 μm ye e sefilwego ka 50:50 ye e tlaleleditšwego RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) e tlaleleditšwego ka 10% ya serum ya AB ya motho yeo e sa šomego ka phišo (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x Tharollo ya penicillin Streptomycin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) le 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) e tlaleletšwa ka 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) le 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Buffer ya go tšhilafatša ya cytometer ya go ela e be e na le 0.22μm ye e sefilwego ya phosphate buffered saline (PBS; Invitrogen) yeo e tlaleleditšwego ka 3% ya serum ya batho ya AB yeo e sa šomego ka phišo (Sigma). Buffer ya go humiša sele e bopilwe ka 0.22μm ya PBS ye e sefilwego gomme e tlaleletšwa ka 0.5% ya serum ya AB ya motho yeo e sa šomego ka phišo (Sigma-Aldrich).
Ka gare ga 37°C ya magareng ye e feletšego, disele di ile tša šilafatšwa ka 10 nM MT DR le 100 μM 2-NBDG ka metsotso ye 30. Se se latelago, disele di ile tša šilafatšwa ka taye ya go kgonagala eF506 ka 4°C ka metsotso ye 15. Emiša gape disele ka gare ga FC Block (eBioscience) le Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), hlatswa ka gare ga flow cytometer staining buffer (go ya ka ditaelo tša motšweletši), gomme o duše metsotso ye 10 ka themperetšheng ya phapoši. Stain disele ka sete ya dithibela-maikwelo (Table S2) ka phallo cytometry staining buffer ka 4 ° C metsotso e 20. Resuspend disele ka phallo cytometry staining buffer (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R peakanyo) pele and analysis. Šomiša SpectroFlo le FlowJo V10 go sekaseka datha ya palo ya disele, gomme o šomiše GraphPad Prism 8 go hlama datha. Boima bja fluorescence bja magareng (MFI) bja 2-NBDG le MT DR bo ile bja log-normalized, gomme ka morago ga moo teko ya t ya dipara e ile ya šomišwa bakeng sa tshekatsheko ya dipalopalo go ikarabela ka balwetši bao ba swanago. Tloša baagi ka moka bao ba nago le ditiragalo tša ka fase ga tše 40 go tšwa tshekatshekong; tsenya boleng bja MFI bja 1 bakeng sa dikelo dife goba dife tše mpe pele o dira tshekatsheko ya dipalopalo le go bona ya data ka leihlo la kgopolo.
E le hore ho tlatsetsa pukwanana gating leano la ka holimo tshebetso phanele, re ile ra sebelisa tlhaloso e feletseng ke sebopeho thibelo sefate (FAUST) (21) ho ka tsela e iketsang abela lisele ho baahi ka mor'a ho felisa lisele tse hwilego ka FlowJo. Re laola ka seatla ditšweletšwa go kopanya baagi bao go bonagalago ba arotšwe gampe (go kopanya PD1 + le disele tša PD1-hlagala) le baagi bao ba bolokilwego. Sampole ye nngwe le ye nngwe e na le palogare ya disele tša go feta 2%, bakeng sa palomoka ya baagi ba 11.
Ficoll gradient density centrifugation e ile ya šomišwa go aroganya PBMC go tšwa go ditšweletšwa tša karoganyo ya leukocyte (STEMCELL Technologies). Disele tša CD8 + T di ile tša arolwa go tšwa go PBMC ka go šomiša CD8 MicroBeads (Miltenyi) gomme tša katološwa ka gare ga sedirišwa se se feletšego ka go šomiša TransAct (Miltenyi) ka dibeke tše 2 go ya ka ditaelo tša motšweletši. Disele di ile tša dumelelwa go ema matšatši a 5 ka gare ga sedirišwa se se feletšego seo se nago le IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), gomme ka morago tša hlohleletšwa gape ka TransAct. Ka letšatši la 7, go ya ka ditaelo tša motšweletši, di-MicroBead tša CD45 tša batho (Miltenyi) di ile tša šomišwa go humiša disele ka dipotologo tše tharo tše di latelanago. Disele di ile tša arolwa ka dikarolo bakeng sa tshekatsheko ya flow cytometry (bjalo ka ge go hlalositšwe ka mo godimo), gomme disele tše milione di ile tša arolwa ka makga a mararo bakeng sa tshekatsheko ya LC-MS/MS. Disampole di ile tša šongwa ka LC-MS/MS bjalo ka ge go hlalošitšwe ka mo tlase. Re ile ra akanyetša boleng bja metabolite bjo bo hlaelelago ka palo ya ion ya 1,000. Sampole ye nngwe le ye nngwe e tlwaetšwa ka palomoka ya palomoka ya ion (TIC), e fetotšwe ka logarithmically le go tlwaetšwa ka go itiriša ka go MetaboAnalystR pele ga tshekatsheko.
Go emišwa ga sele e tee ya molwetši yo mongwe le yo mongwe go ile gwa tološwa gomme gwa sefiwa ka sefa ya 40 μm ka gare ga sedirišwa se se feletšego (bjalo ka ge go hlalošitšwe ka mo godimo). Go ya ka protocol ya motšweletši, dipotologo tše tharo tše di latelanago tša kgetho ye botse ka karoganyo ya dipheta tša makenete ka go šomiša MicroBeads (Miltenyi) di šomišitšwe go humiša dišupo tša disele tša CD8+, CD4+ le CD45- (godimo ga leqhwa). Ka boripana, disele di emišwa gape ka gare ga buffer ya go humiša disele (bjalo ka ge go hlalositšwe ka mo godimo) gomme tša balwa. Disele di ile tša bjalwa ka dipheta tša CD8 tša batho, dipheta tša CD4 tša batho goba dipheta tša CD45 tša batho (Miltenyi) ka 4°C metsotso ye 15, gomme ka morago tša hlatswiwa ka buffer ya go humiša disele. Sampole e fetišwa ka kholomo ya LS (Miltenyi), gomme dikarolwana tše botse le tše mpe di a kgoboketšwa. Gore go fokotšwe nako le go godiša kgato ya go tsošološa sele, karolwana ya CD8 e šomišwa ka morago bakeng sa tikologo ya bobedi ya go humiša CD4+, gomme karolwana ya CD4 e šomišwa bakeng sa go humiša CD45 ye e latelago. Boloka tharollo godimo ga leqhwa nakong ka moka ya tshepedišo ya karoganyo.
Go lokišetša dišupommu bakeng sa tshekatsheko ya metabolite, disele di ile tša hlatswiwa gatee ka tharollo ya letswai ye e tonyago bjalo ka leqhwa, gomme 1 ml ya 80% ya methanol e ile ya tlaleletšwa go sampole ye nngwe le ye nngwe, ke moka ya vortexed gomme ya gatsetša ka snap ka gare ga naetrotšene ya seela. Disampole di ile tša bewa ka fase ga didikologa tše tharo tša go gatsela-go qhibidiga gomme tša centrifuged ka 14,000 rpm ka metsotso ye 15 ka 4°C. Supernatant yeo e nago le di-metabolite e moyafala go fihlela e oma. Dimetabolite di ile tša hlapološwa gape ka gare ga 50 μl ya 0.03% ya esiti ya formic, tša vortexed go hlakanya, gomme ka morago tša centrifuged go tloša ditlakala.
Ntšha di-metabolite bjalo ka ge go hlalositšwe ka mo godimo. Fetišetša supernatant go lebotlelo la chromatography ya seela sa tshepedišo ya godimo bakeng sa nyakišišo ya metabolomics. Šomiša protocol ya kalafo ya go se kgethe go alafa sampole ye nngwe le ye nngwe ka palo ye e swanago ya disele go thibela ditlamorago tša sehlopha. Re dirile kelo ya boleng ya di-metabolite tša lefase ka bophara tšeo di phatlaladitšwego peleng go AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Tshekatsheko ya chromatographic le kopanyo ya lefelo la tlhōrō di dirilwe ka go šomiša MultiQuant phetolelo 2.1 software (Applied Biosystems SCIEX).
Palo ya ion ya 1000 e ile ya šomišwa go akanyetša boleng bja metabolite bjo bo hlaelelago, gomme TIC ya sampole ye nngwe le ye nngwe e ile ya šomišwa go bala lefelo la tlhora ye e tlwaelegilego ya metabolite ye nngwe le ye nngwe ye e lemogilwego go phošolla diphetogo tšeo di tsebagaditšwego ke tshekatsheko ya sedirišwa go tšwa go tshepedišo ya sampole. Ka morago ga gore TIC e tlwaelegile, MetaboAnalystR (51) (paramethara ya go se fetoge) e šomišwa bakeng sa phetošo ya logarithmic le go lekanya mola wa tlwaelo wa go itiriša. Re ile ra diriša PCA ka sephuthelwana sa vegan R go dira tshekatsheko ya go nyakišiša ya diphapano tša metabolome magareng ga mehuta ya sampole, gomme ra diriša tshekatsheko ya go fokotša mošomo ka karolo go sekaseka balwetši. Šomiša mokgwa wa Ward go aga dendrogram ya mmapa wa phišo go kgoboketša sekgala sa Euclidean magareng ga dišupo. Re ile ra sebelisa limma (52) ka standardized metabolite ngata ho hlwaya differentially ngata metabolites ho pholletsa le mofuta oohle sele le microenvironment. E le hore ho nolofatsa tlhaloso, re sebelisa sehlopha bolela paramethara ho laela mohlala, 'me nahana ka mefuta ea lisele ka microenvironment e le sehlopha se seng le se seng (n = 6 dihlopha); bakeng sa teko ya bohlokwa, re ile ra dira ditekanyo tše tharo tše di boeletšwago bakeng sa metabolite e nngwe le e nngwe E le gore re pheme phetolelo ya maaka, molwetši o ile a akaretšwa e le lepheko tlhamong ya limma. Gore re kgone go hlahloba diphapano tša di-metabolite magareng ga balwetši ba go fapana, re ile ra beakanya mohlala wa limma go akaretša le balwetši ka tsela ye e sa fetogego. Re bega bohlokwa bja phapano ye e laeditšwego pele magareng ga mohuta wa sele le microenvironment ya Padj <0.05 (Benjamini-Hochberg correction).
Ka morago ga go humišwa ka maatla ka go šomiša Miltenyi Dead Cell Removal Kit (> 80% ya go kgonagala), tatelano ya transcriptome ya sele e tee e dirilwe go palomoka ya ascites ye e gatseditšwego ye e phelago le dišupommu tša hlagala ka go šomiša protocol ya polelo ya 10x 5′gene. Dikgetse tše hlano tšeo di nago le dihlagala tše di swanago le ascites di ile tša hlahlobja, le ge e le gore go kgonagala ga fase go tšwa go sampole e tee ya hlagala go ile gwa thibela go akaretšwa ga yona. E le gore re fihlelele dikgetho tše ntši tša balwetši, re ile ra kopanya disampole tša molwetši yo mongwe le yo mongwe ka ditseleng tša molaodi wa chromium wa 10x, gomme ra sekaseka mafelo a ascites le hlagala ka thoko. Ka morago ga tatelano [Illumina HiSeq 4000 28 × 98 bp paired qetellong (PE), Quebec genome; karolelano ya 73,488 le 41,378 bala ka sele bakeng sa hlahala le ascites ka ho latellana]], re ile ra sebelisa CellSNP le Vireo (53) (e thehiloeng CellSNP e le The tloaelehileng batho SNP (VCF) e filwe ke GRCh38 e abelwa boitsebiso ba mofani. go sa akaretšwe disele tšeo di sa abelwago le disele tšeo di hlaotšwego bjalo ka di-duplex le baabi ba go swana magareng ga disampole tša ascites le hlagala ( 54 ). (2792 and 4183 cells from tumor and ascites, respectively) for analysis. We use igraph's (57) Louvain clustering of shared nearest neighbor network (SNN) based on Jaccard distance to cluster cells by expression. The clusters were manually annotated to putative cell types based on marker gene expression and visualized with t-SNE. Cytotoxic T cells are e hlalositšwego ke polelo ya CD8A le GZMA, go sa akaretšwe dihlopha tše nnyane tšeo di nago le polelo ya proteine ​​ya ribosomal ya fase Re fihleletše ya data ye e phatlaladitšwego ya Izar et al (16), go akaretšwa le go tsenywa ga bona t-SNE, ka laola go kopana ga polelo magareng ga maswao a sele ya boitshireletšo bja mmele.
PBMC di ile tša arolwa go tšwa go ditšweletšwa tša karoganyo ya leukocyte (STEMCELL Technologies) ka Ficoll gradient density centrifugation. Disele tša CD3 + di ile tša arolwa go tšwa go PBMC ka go šomiša dipheta tša CD3 (Miltenyi). Ka go ba gona goba go se be gona ga MNA, disele tša CD3+ di ile tša šomišwa ka CD3 yeo e tlemilwego ka poleiti (5μg/ml), CD28 ye e qhibidigago (3μg/ml) le IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Ka letšatši la mafelelo la katološo, go kgonagala (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) le go ata (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) di ile tša hlahlobja ka cytometry ya go ela. Lekola mošomo wa effector ka go hlohleletša disele ka PMA (20 ng/ml) le ionomycin (1μg/ml) ka GolgiStop ka diiri tše 4, gomme o hlokomele CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) le TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Hlohleletša disele tša qPCR le ChIP ka PMA (20 ng/ml) le ionomycin (1μg/ml) ka diiri tše 4. The ELISA supernatant ile bokella pele le ka mor'a tlhotlheletso le PMA (20 ng / di ml) le ionomycin (1 μg / ml) bakeng sa lihora tse 4.
Latela protocol ya motšweletši go arola RNA ka go šomiša RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Diriša QIAshredder (QIAGEN) go homogenize sampole. Diriša RNA ya bokgoni bjo bo phagamego go ya go cDNA kit (Thermo Fisher Scientific) go kopanya DNA ya tlaleletšo (cDNA). Diriša TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) go lekanyetša palo ya polelo ya dikarolwana tša leabela (go ya ka protocol ya motšweletši) ka di-probe tše di latelago: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-fosfate tima Hydrogen (GAPDH)] le Hs01010726_m1 (SLC22A2). Disampole di ile tša sepedišwa ka tshepedišo ya PCR ya nako ya nnete ya StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) ka gare ga poleiti ya karabelo ya didiba tše 96 ya go bona ka lebelo ya MicroAmp (Applied Biosystems) ka filimi ya go bona ya MicroAmp. Boleng bofe goba bofe bja Ct bjo bo fetago 35 bo tšewa bjalo ka bjo bo ka godimo ga moedi wa go utolla gomme bo swailwe bjalo ka bjo bo sa lemogegego.
Dira ChIP bjalo ka ge go hlalositšwe peleng (58). Ka boripana, disele di ile tša alafša ka formaldehyde (tekanyetšo ya mafelelo 1.42%) gomme tša bjalwa ka themperetšheng ya phapoši metsotso ye 10. Diriša buffer ya go ruruga ye e tlaleleditšwego (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl le 0.1% NP-40) godimo ga leqhoa ka metsotso ye 10, ke moka o e emiše gape ka gare ga buffer ya immunoprecipitation bjalo ka ge go hlalošitšwe (58 ). Sampole e ile ea sonicated le didikadikwe tse latelang: didikadikwe 10 (20 1-motsotsoana pulses) le nako e sa fetoheng ea metsotswana e 40. Duša ChIP-grade immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) le SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) dithibela-maikwelo ka sampole ka 4°CC šišinyega bošego ka moka. Duša dipheta tša proteine ​​A (Thermo Fisher Scientific) ka sampole ka 4°C ka go šišinya ka boleta ka iri ye 1, ke moka o šomiše dipheta tša chelex (Bio-Rad) go humiša DNA, gomme o šomiše proteinase K (Thermo Fisher) go tšhilo ya proteine. TNFα mohlohleletši o ile a lemogwa ka PCR: pele, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; ka mo go fapanego, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (sehlahiswa sa 207-bp). Diswantšho di tšweleditšwe ke Image Lab (Bio-Rad) gomme tša balwa ka go šomiša softwere ya ImageJ.
Supernatant ya setšo sa sele e ile ya kgoboketšwa bjalo ka ge go hlalošitšwe ka mo godimo. Boikemišetšo bo dirilwe go ya ka ditshepedišo tša motšweletši tša sedirišwa sa TNFα ELISA sa batho (Invitrogen), sedirišwa sa IL-2 ELISA sa motho (Invitrogen) le sedirišwa sa IFN-γ ELISA sa motho (Abcam). Go ya ka protocol ya motšweletši, supernatant e ile ya hlapološwa ka 1:100 go utolla TNFα le IL-2, le 1:3 go utolla IFN-γ. Šomiša EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) go ela go monya ka 450 nm.
PBMC di ile tša arolwa go tšwa go ditšweletšwa tša karoganyo ya leukocyte (STEMCELL Technologies) ka Ficoll gradient density centrifugation. Disele tša CD3 + di ile tša arolwa go tšwa go PBMC ka go šomiša dipheta tša CD3 (Miltenyi). Ka go ba gona goba go se be gona ga MNA, disele tša CD3+ di ile tša šomišwa ka CD3 yeo e tlemilwego ka poleiti (5μg/ml), CD28 ye e qhibidigago (3μg/ml) le IL-2 (300 U/ml; Proleukin) ka matšatši a 3. Ka morago ga matšatši a 3, disele di ile tša kgoboketšwa gomme tša hlatswiwa ka 0.9% ya letswai, gomme pellet e ile ya gatsetša ka lebelo. Palo ya disele e ile ya dirwa ka cytometry ya go ela (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R peakanyo) ka go šomiša 123count eBeads.
Ntšha di-metabolite bjalo ka ge go hlalositšwe ka mo godimo. Setsopolwa se se omilego se ile sa bopša gape ka mahloriso a 4000 ya disele tše di lekanago/μl. Sekaseka sampole ka chromatography ya mogato o bušeditšwego morago (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) le kholomo ya CORTECS T3 (2.1 × 150 mm, bogolo bja dikarolwana 1.6-μm, bogolo bja pore 120-Å; #186008500, Meetse). Polar boima spectrometer (6470, Agilent), eo ho eona electrospray ionization sebetsa ka mokgwa wa positive. Mohato wa sellathekeng A ke 0.1% ya esiti ya formic (ka H2O), kgato ya sellathekeng B ke 90% ya acetonitrile, 0.1% ya esiti ya formic. Gradient ya LC ke metsotso ye 0 go ya go ye 2 ya 100% A, metsotso ye 2 go ya go ye 7.1 ya 99% B, le metsotso ye 7.1 go ya go ye 8 ya 99% B. Ke moka o lekaleletše kholomo gape ka kgato ya go sepela A ka seelo sa go ela sa 0.6 ml/min ka metsotso ye 3. . Sekgahla sa go ela ke 0.4ml/min, gomme phapoši ya kholomo e fišwa go fihla go 50°C. Diriša maemo a dikhemikhale a hlwekilego a MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) go hloma nako ya go boloka (RT) le phetogo (RT = 0.882 metsotso, phetogo 1 = 137→94.1, phetogo 2 = 137→92 , Phetošo 3 = 137→78). Ge diphetogo ka moka tše tharo di direga ka nako ya go boloka ye e nepagetšego, phetogo ya 1 e šomišwa go ela boleng go netefatša go kgethegile. The maemo a koba ya MNA (Toronto Research Chemical Company) e ile ya tšweletšwa ke dilutions tše tshela tša tatelano ya tharollo ya setoko (1 mg/ml) go hwetša maemo a 0.1, 1.0, 10 le 100 ng/ml le 1.0 le 10μg/ml ka go latelelana seela. Moedi wa go utolla ke 1 ng/ml, gomme karabelo ya linear e magareng ga 10 ng/ml le 10μg/ml. Ente ye nngwe le ye nngwe ya di-microlitre tše pedi tša sampole le maemo e šomišwa go tshekatsheko ya LC/MS, gomme sampole ya taolo ya boleng ye e hlakantšwego e sepedišwa diente tše dingwe le tše dingwe tše seswai go netefatša go tsepama ga sefala sa tshekatsheko. Dikarabelo tša MNA tša dišupommu ka moka tša disele tšeo di alafilwego ka MNA di be di le ka gare ga tekanyo ya mothalo ya tshekatsheko. Tshekatsheko ya datha e dirilwe ka go šomiša softwere ya tshekatsheko ya boleng ya MassHunter (v9.0, Agilent).
Sebopego sa moloko wa bobedi sa αFR-CAR se tšerwe go tšwa go Song et al. (59) (59). Ka boripana, sebopego se na le dikagare tše di latelago: tatelano ya moetapele wa CD8a, karolwana ya go fetoga ya ketane e tee ye e itšego ya αFR ya motho, hinge ya CD8a le selete sa transmembrane, domain ya ka gare ga sele ya CD27 le domain ya ka gare ga sele ya CD3z. Tatelano ye e feletšego ya CAR e ile ya hlangwa ke GenScript, gomme ka morago ya tšweletšwa ka gare ga vector ya polelo ya lentiviral ya moloko wa bobedi ka godimo ga khasete ya polelo ya GFP yeo e šomišitšwego go sekaseka bokgoni bja phetolelo.
Lentivirus e tšweletšwa ka phetetšo ya disele tša HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); e bjetšwe ka gare ga sedirišwa sa Eagle se se fetotšwego sa Dulbecco seo se nago le 10% ya serum ya kgomo ya fetus (FBS) le 1% ya PenStrep, gomme e šomišitšwe CAR-GFP vector le Diplasmid tša go phuthela (psPAX2 le pMD2.G, Addgene) di šomiša lipofection amine (Sigma-Aldrich). Supernatant yeo e nago le twatši e ile ya kgoboketšwa diiri tše 48 le 72 ka morago ga phetetšo, ya sefiwa gomme ya tsepama ka ultracentrifugation. Boloka supernatant ya twatši ye e tseneletšego ka -80°C go fihlela phetolelo.
PBMC di arogantšwe go tšwa go ditšweletšwa tša karoganyo ya leukocyte ya moabi tše di phetšego gabotse (STEMCELL Technologies) ka Ficoll gradient density centrifugation. Šomiša dipheta tše nnyane tša CD8 tša kgetho ye botse (Miltenyi) go arola disele tša CD8+ go tšwa go PBMC. Hlohleletša disele tša T ka TransAct (Miltenyi) le ka gare ga sedirišwa sa TexMACS [Miltenyi; e tlaleleditšwe ka 3% ya serum ya batho yeo e sa šomego ka phišo, 1% ya PenStrep le IL-2 (300 U/ml)]. Diiri tše masomepedi-nne ka morago ga tlhohleletšo, disele tša T di ile tša fetošwa ka lentivirus (10 μl ya supernatant ya twatši ye e tsepamego ka disele tše 106). Matšatši a 1 go ya go a 3 ka morago ga phetolelo go Cytek Aurora (go FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP +), hlahloba polelo ya GFP ya disele go bontšha bokgoni bja phetošo bja bonyane 30% .
Disele tša CAR-T di ile tša godišwa diiri tše 24 ka go Immunocult (STEMCELL Technologies; e tlaleleditšwe ka 1% PenStrep) ka fase ga maemo a a latelago: ga se tša alafša, di alafša ka 250 μM adenosine goba 10 mM MNA. Ka morago ga kalafo ya pele, disele tša CAR-T di ile tša hlatswiwa ka PBS gomme tša kopanywa le disele tše 20,000 tša SK-OV-3 [ATCC; ka gare ga McCoy 5A (Sigma-Aldrich) yeo e tlaleleditšwego ka 10% FBS le 1% PenStrep ka 10: Karolelano ya effector go ya go nepišo ya 1 e ile ya godišwa ka makga a mararo ka gare ga sedirišwa sa Immunocult seo se tlaleleditšwego. Disele tša SK-OV-3 le disele tša SK-OV-3 tšeo di lysed ka digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) di ile tša šomišwa bjalo ka taolo ye mpe le ye botse, ka go latelelana. Ka morago ga diiri tše 24 tša temo mmogo, supernatant e ile ya kgoboketšwa gomme lactate dehydrogenase (LDH) e ile ya elwa go ya ka ditaelo tša motšweletši (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). The LDH supernatant ile hlapolotsoeng 1:50 ka LDH buffer. Peresente ya polao e ile ya lekantšhwa ka go šomiša formula ye e latelago: phesente ya polao = phesente ya phošollo / palomoka ya seelo sa polao x 100%, moo phesente ya phošollo = disele tša co-culture-T fela, le palomoka ya seelo sa polao = taolo ye botse-taolo ye mpe.
Bjalo ka ge go hlalošitšwe ka go sengwalwa goba didirišwa le mekgwa, šomiša GraphPad Prism 8, Microsoft Excel goba R v3.6.0 bakeng sa tshekatsheko ya dipalopalo. Ge e ba dišupo tše dintši di kgoboketšwa go tšwa go molwetši o tee (go swana le ascites le hlagala), re diriša teko ya t ya dipara goba re akaretša molwetši e le mafelelo a sa rulaganyetšwago mohlaleng wa mothalo goba wa kakaretšo ka mo go swanetšego. Bakeng sa tshekatsheko ya metabolomics, teko ya bohlokwa e dirwa ka makga a mararo.
Bakeng sa didirišwa tša tlaleletšo tša sehlogo se, hle bona http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Ye ke sengwalwa sa phihlelelo ye e bulegilego seo se phatlalatšwago ka fase ga dipeelano tša Laesense ya Creative Commons Attribution-Non-Commercial, yeo e dumelelago tšhomišo, kabo le go tšweletša gape ka gare ga sedirišwa sefe goba sefe, ge fela tšhomišo ya mafelelo e se ya poelo ya kgwebo gomme motheo e le gore mošomo wa mathomo o nepagetše. Tšhupetšo.
Ela hloko: Re go kgopela fela gore o nee aterese ya gago ya imeile gore motho yo o mo kgothaletšago letlakaleng a tsebe gore o nyaka gore a bone imeile yeo le gore ga se spam. Re ka se thope diaterese tša imeile dife goba dife.
Potšišo ye e šomišwa go leka ge eba o moeti le go thibela go romela ga spam ka go itiriša.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zakaria (Lauren G. Zakaria), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. J o n s s ), P h i n e a s T. M a m l a l l ( P h i n e a s T.
MNA e tlaleletša go gateletšeng ga masole a mmele ga disele tša T gomme e emela sepheo seo se ka bago gona sa kalafo ya masole a mmele bakeng sa kalafo ya kankere ya batho.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zakaria (Lauren G. Zakaria), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. J o n s s ), P h i n e a s T. M a m l a l l ( P h i n e a s T.
MNA e tlaleletša go gateletšeng ga masole a mmele ga disele tša T gomme e emela sepheo seo se ka bago gona sa kalafo ya masole a mmele bakeng sa kalafo ya kankere ya batho.
©2021 Mokgatlo wa Amerika wa Tšwetšopele ya Saense. ditokelo tsohle di sireleditswe. AAAS ke molekane wa HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef le COUNTER. Kgatelopele ya Mahlale ISSN 2375-2548.